【商检行业标准(SN)】 国境口岸拉沙热检验规则

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1502--2005
国境口岸拉沙热检验规程
Examination codes for Lassa fever at frontier port2005-02-17发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2005-07-01实施
本标准的附录C、附录D为规范性附录，附录A、附录B为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局。本标准主要起草人：何晨光、刘德宝、王馨、祁军、柴宏森、刘振宇。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。SN/T1502—2005
1范围
国境口岸拉沙热检验规程
SN/T1502—2005
本标准规定了国境口岸拉沙热的检验对象、检验方法、检验结果报告，及阳性结果的处置方法。本标准适用于国境口岸拉沙热的检验。2术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。2.1
拉沙热Lassafever
由拉沙热病毒引起的一种急性传染病，其传染性极强，可通过直接接触而传插，也可通过气溶胶传播。本病起病急，临床表现严重、病死率高，对人类的生命和健康危害很大。3对象
国境口岸拉沙热的检验对象包括：拉沙热爆发期间来自爆发地且未超过潜伏期的所有人员；一来自拉沙热疫区具有拉沙热临床症状的病人。4标本的采集和处理
4.1标本的采集
4.1.1病人血清
病人第一份血液标本为发病后3d内的急性期标本，第二份为发病2周或4～8周的恢复期标本。标本采集后在冷藏条件下迅速送P4实验室，立即分离血清。若不能即刻做细胞培养，该标本应置于超低温冰箱一80℃或液氮罐内保存。4.1.2病人体液、排泄物
采集发病3d～4d病人的咽部嗽液、胸腔积液和尿液等在冷藏条件下迅速送至P4实验室，进行病毒分离培养和其他检测。
4.2标本的标识
采集的标本应进行标识，连同相关记录一并送实验室。4.3实验样品转运
实验样品的转运应注意下列事项：所有需要转运的实验样品必须标明“传染性物质，拉沙热病毒”：一短途运输必须使用专车，由专人运送。尽可能避免长途转运，如确需要空运的实验样品应按照传染性物品运输的规定办理：
样品的容器要使用能够承受不少于95kPa压力的高质量的防水包装材料并且密封，以防止运输过程中发生内容物的外泄；
第二层和第三层包装中应使用吸水性好的柔软物质充填；一几个易碎的容器在同一个包裹中运输时，应分别独立包装并相互隔离，以免相互碰撞。1
SN/T1502—2005
5准备
实验室常用设备和器材参见附录A，常用溶液及配制参见附录B。6实验室检验
国境口岸拉沙热实验室检验内容如下：抗体检测；
病毒分离鉴定；
一抗原检测；
核酸分子检测。
具体检验方法见附录C。
7生物安全措施
拉沙热实验室的生物安全及防护措施按照附录D的要求执行。8检验结果报告
8.1单份血清检测
单份血清标本特异性抗体1：400以上，报告为“拉沙热病毒抗体阳性”，单份血清标本病毒抗原1：16以上，报告为“拉沙热病毒抗原阳性”，结合临床表现具有诊断意义。8.2双份血清检测
患者双份血清特异性抗体检测，恢复期血清抗体效价较急性期增高4倍及以上时，报告为“拉沙热病毒抗体阳性”。
8.3间接免疫荧光试验
单份血清标本1：50稀释呈阳性或双份血清效价增高4倍以上时，报告经间接免疫荧光试验证实为“拉沙热病毒抗体阳性”。
8.4病毒分离鉴定
将含病毒材料接种细胞培养，出现明显细胞病变，并经间接免疫荧光法（IFA）鉴定证实，报告为“检出拉沙热病毒”。
8.5病毒核酸分子检测
用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR)法从中检测到拉沙热病毒特异性NP或GP1或GP2基因，报告为“检出拉沙热病毒特异性NP基因”。8.6免疫印迹试验
膜条上有均一色点，报告经免疫印迹试验确认为“拉沙热病毒抗体阳性”。9阳性结果的处置
对病毒分离株及其他阳性结果的相应标本应送有资质的实验室做复检或鉴定。阳性结果应及时向上级主管部门报告。
A.1实验设备
附录A
（资料性附录）
实验室检验设备与器材
SN/T1502—2005
按照国际标准建设，并经有关部门组织专家全面验收合格的生物安全防护4级（BLS-4或P4）实验室和相应的配套设施，以及严格的工作规章制度。A.2主要仪器
落射式荧光显微镜。
低温超速离心机（100000g）。
超低温冰箱（一80C)、液氮储存罐。Y-射线照射装置。
PCR检测仪。
双门高压灭菌器、熏蒸消毒柜。电泳仪、垂直平板电泳槽、转移电泳槽、透射反射仪等。细胞培养用器材
一次性无菌有盖塑料细胞培养瓶（25cm2）。37℃恒温培养箱（内置细胞瓶旋动培养装置）。全排式生物安全柜。
负压抽滤瓶、电动真空泵。
电渗析-离子交换纯水器、石英玻璃重蒸馅器。电热干烤箱、高压蒸汽灭菌器普通冰箱（0℃~一20℃）。可调式微量加样器及塑料尖吸头。玻璃吸管、量筒、三角烧、硅石珠。普通冰箱（0℃～一20℃）。
血清学实验用主要器材
96孔微孔反应板。
微量加样器、振荡器。
37℃及56℃温箱。
A.4.4电动离心机。
A.4.5普通冰箱。
A.4.6酶标检测仪、洗板机。
A,4.712孔Teflon玻片。
SN/T1502—2005
B.1抗体检测常用试剂
附录B
（资料性附录）
实验室检验常用试剂及配制
B.1.1样品稀释液：0.01mol/LPBS-脱脂奶溶液（pH7.2，含0.1%Tween-20)B.1.2洗涤液：pH7.4的PBS溶液（含0.1%Tween-20)。B.1.3酶结合物：辣根过氧化物酶标记抗鼠IgM抗体，辣根过氧化物酶标记鼠链特异性抗人IgG抗体（稀释度1：10000）。
显色液：等量的ABTS过氧化物酶和过氧化氢酶的混合物。1%TritonX-100。
0.01mol/L硼酸盐水(pH9.0)。
0.1 mol/LTris。
Eagles基础培养基（含Eagle盐，在培养基中加人2%热灭活的牛胚胎血清，100U/mL青霉素，100pg/mL链霉素，50pg/mL庆大霉素）。B.1.9
冰冻培养基（95%小牛胚胎血清，5%二甲基亚砜）。丙酮。
异硫氰酸荧光素标记羊抗人Ig抗体。1%伊文氏蓝溶液。
10%甘油PBS(pH8.2)。
抗原检测常用试剂
包被缓冲液：pH7.4的PBS溶液（0.01%硫柳汞）。样品稀释液：0.01mol/LPBS-脱脂奶溶液（pH7.2含0.1%Tween-20）。阳性抗体：等量的抗拉沙热病毒核蛋白单克隆抗体的混合。阴性对照：骨髓瘤患者腹水。
酶结合物：辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG抗体。RT-PCR方法使用试剂
GIT裂解缓冲液［4.5mol/LGIT，50mmol/LTris-HCI（pH6.5），20mmol/LEDTA(pH 8.0),1.2%TritonX-100]。
GIT洗液[5mol/LGIT,50mmol/LTrisHCI(pH6.5)]。70%酒精。
5×反应液。
1mol/L二硫基苏糖醇(DTT)。
三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs)[2mmol/L(each)dATP，dTTP,dCTP,dGTP]。DEPC·H,O。
标记逆转录酶。
10XPCR缓冲液。
免疫印迹使用试剂
鸡溶解素
2%SDS。
100mmol/LDTT。
50mmol/LTris-HCl(pH6.8)。
甲醇。
SN/T1502—2005
TBSTE10mmol/LTris-HCl(pH7.8),150mmol/LNaCI,0.1%Tween-20J.10% NFM(Nohtat Milk)。
NT缓冲液[100mmol/LNaCI,10mmol/LTris-HCl(pH7.8)]。0.2%H202。
氯-1-萘酚。
SN/T1502—2005
C.1拉沙热病毒抗体检测
附录C
（规范性附录）
拉沙热的实验室检验
C.1.1IgM的检测（双抗原夹心ELISA法）C.1.1.1操作步骤
按下列步骤操作：
用拉沙病毒转染VeroE6细胞，大约6d后用免疫荧光法检测转染情况，将成功转染的VeroE6a)
细胞先用0.1mol/LTris(pH8.5)加人培养基中，再将培养瓶冻融，然后将细胞与培养基冰冻于塑料瓶中，并热封于两个袋子后，可以从BLS-4级实验室中取出，以20000Gy的射线照射，并用。随后，将其解冻分装小瓶备用。无病毒转染VeroE6细胞制备阴性对照抗原。b）用包被缓冲液将羊抗M链抗体稀释为1：500包被微孔板，4℃过夜弃去孔内液体，每孔内注人PBS溶液（pH7.4含0.1%Tween-20）250μL，静置4s，甩干，再冲c
洗，重复三次后拍干。或选用洗板机选择三次程序洗板后拍干。将待测血清用样品稀释液以4倍进行倍比稀释，稀释度为1：100～1：6400，每孔加人100μLd)
样品混匀，封板，置湿盒内37℃孵育1h。重复上述洗板步骤。
将微孔板分为上、下两部分分别加人阳性抗原、阴性抗原对照100μL，混匀，封板，置湿盒内37℃f
孵育1h。
重复上述洗板步骤。
每孔加入用拉沙热病毒超免疫的小鼠腹水（稀释度为1：2000），混勾，封板，置湿盒内37℃孵育1h。
重复上述洗板步骤。
每孔加人酶结合物100μL，混匀，封板，置湿盒内37℃孵育1hj）
重复上述洗板步骤。
加人底物显色，混匀，封板，置37℃孵育30min。1)
m）用酶标仪读数，波长410nm读取各孔A41o值（建议使用双波长进行比色，参考波长为620nm）。C.1.1.2结果判定
按照校正A41o=阳性抗原A4o一抗原对照Aa10，计算各滴度校正Ano，要求各滴度校正Aa1e大于等于0.1，当血清样本滴度大于等于1：400且总校正Aao大于等于0.6判断为阳性（总校正A41为各滴度孔校正A4的总和）。
C.1.2IgG的检测（双抗原夹心ELISA法）C.1.2.1操作步骤
按下列步骤操作：
a）病毒转染VeroE6细胞方法同C.1.1.1a)项，将成功转染的细胞悬液在4℃条件下10000g离心10min，后用0.01mol/L硼酸盐水（pH9.0）洗涤一次。将沉淀物在酮酸盐水中用1%TritonX-100再次混悬，然后加入冰杯中超声波震碎，再于4℃条件下10000g离心5min，将上清液取出，可以从BLS-4级实验室中取出，Y射线照射，方法同C1.1.1a)项。将制备好的抗原用PBS溶液（含0.1%Tween-20）洗涤三次，备用。模拟病毒转染VeroE6过程制备阴性对照抗原。6
SN/T1502—2005
用包被缓冲液将阳性抗原和对照抗原分别稀释为1：1000，将微孔板分为两部分，分别包被两b)
种抗原，4℃过夜。
洗板，其过程同c.1.1.1c)项。
加样，其过程同C.1.1.1d)～j)。重复上述洗板过程。
每孔加人酶结合物100μL，混勾，封板，置湿盒内37℃孵育1h。重复上述洗板步骤。
加人底物显色，混匀，封板，置37℃孵育30min。i）用酶标仪读数，波长410nm读取各孔A41a值（建议使用双波长进行比色，参考波长为620nm）。C.1.2.2结果判定
按照校正A410=阳性抗原A4o一抗原对照A0，计算各滴度校正A0，要求各滴度校正Al大于等于0.2，当血清样本滴度大于等于1：400且总校正A大于等于1.0判断为阳性（总校正A4o为各滴度孔校正A40的总和）。
C.1.3间接免疫荧光检测(IFA)
C.1.3.1操作步骤
按下列步骤操作：
a）在Eagles基础培养基上VeroE6单层细胞中培养拉沙热病毒。预培养8d后，收获细胞，将其用冰冻培基混悬，从BSL-4实验室中取出，用-射线以20000Gy照射，一70℃保存备用。b）将转染细胞和未转染细胞分别解冻，用PBS溶液将两者混匀，转染细胞数：未转染细胞数比例约为3：2为适。准备12孔Teflon玻片，每孔注人上述混合液20μL包被玻片，风干，用一20℃冰丙酮固定，一70℃保存备用。
用电吹风解冻玻片。倍比稀待测血清（1：50、1：100、1：200、1：400、1：800、1：1600），在c
玻片上加待测血清、阴性对照、阳性对照，37℃孵育30min，用PBS（pH7.2）洗涤15min。将稀释度为1：50的荧光标记的羊抗人Ig-FITC与10μL的1%伊文氏蓝溶液混合，加人玻片d)
中。37℃孵育30min，洗片，加盖玻片用10%甘油PBS（pH8.2)封片，荧光显微镜下观察。C.1.3.2结果判定
细胞质中有特异性荧光的为阳性，如待测血清稀释度为1：1600仍呈阳性，应将血清再倍比稀释为1+200、1400、1:800、1:1600、1：3200、1：6400重新检测。C.2病毒分离
C.2.1操作步骤
按下列步骤操作：
a）在25cm2塑料细胞培养瓶中，将50μL血清接种在VeroE6单层细胞中，37℃30min，加入70mLEagle's基础培养基，再将培养瓶放回培养箱。b）第7d更换培养基，第14d刮取部分细胞，备用。其余培养细胞可用于RT-PCR。将1mL细胞悬液和14mLPBS溶液加入容量15mL的圆维形管中，1000g离心Smin，弃去上清，将沉淀混悬制片（制备步骤同C.1.3.1），风干后将玻片双层包装，从BSL-4实验室中取出，用y-射线以20000Gy照射，冰丙酮固定10min，4℃保存备用。d）将拉沙热病毒超免疫小鼠腹水用PBS-脱脂奶溶液稀释至1：100，加人玻片的孔中，37℃湿盒中1h，用PBS溶液（pH7.2）洗涤10min，风干。e
将稀释度为1：50的荧光标记的羊抗人IgG-FITC与10μL的1%伊文氏蓝混合，加人玻片中。37℃孵育30min，洗片，加盖玻片用10%甘油PBS（pH8.2）封片，荧光显微镜下观察。7
SN/T1502--2005
C.2.2结果判定
细胞质中有特异性荧光的为阳性。C.3抗原检测
C.3.1操作步骤
按下列步骤操作：
用包被级冲液将阳性抗体和对照抗体分别稀释为1：500，将微孔板分为阳性、阴性孔各一半，分a)
别加入两种抗体，4℃过夜。
洗板过程同C.1.1.1e)项。
将待测血清用样品稀释液以4倍进行倍比稀释，稀释度为1：4～11256，每孔加人100μL样品混匀，封板，置湿盒内37℃孵育1h。d)
重复上述洗板步骤。
每孔加入稀释度为1：2000的超免疫免抗拉沙热病毒抗体100μL，混匀，封板，置湿盒内37℃孵育1h。
重复上述洗板步骤。
每孔加人酶结合物100μL，混匀，封板，置湿盒内37℃孵育1h。重复上述洗板步骤。
加人底物显色，混匀，封板，置37℃孵育30min。j）用酶标仪读数，波长410nm读取各孔A41值（建议使用双波长进行比色，参考波长为620nm）。C.3.2结果判定
按照校正A1=阳性抗原A41e一抗原对照A10，计算各滴度校正A410，要求各滴度校正A410大于等于0.1，当血清样本滴度大于等于1：16且总校正A大于等于0.6判断为阳性（总校正A为各滴度孔校正A41的总和）。
C.4逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）C.4.1操作步骤
按下列步骤操作：
标本RNA的提取：即用100μL血清或尿液标本混合900μLGIT裂解缓冲液，加人15uL盐酸a）
处理的硅石珠室温孵育15min后，搅动硅石珠再用GIT洗液洗涤两次，用70%酒精洗两次，用丙酮洗一次；将珠子于56℃干燥30min，用50μL焦碳酸二乙酯处理的水将珠于上的核酸溶下。样本于一70℃储存备用。为了避免污染的问题，准备、贮存标本以及进行PCR实验要在不同的实验室中进行。
cDNA转录反应：用缓冲液配置20uL反应物并加人TaqDNA多聚酶，其中反应物包括5μL抽b）
提出的核酸，3.2U鼠白血病病毒反转录酶，1mmol/L三磷酸脱氧核苷酸（dATP、dTTP、dCTP，dGTP)，20URNAsin核糖核酸酶抑制因子，50nmol/L引物80F2（5-ATATAATGATGACTGTTGTTCTTTGTGCA-3），2.65mmol/L氯化镁，50mmol/L氯化钾，2.5mmol/LDTT，10mmol/LTris-HClpH9.0），0.1%TritonX-100。将混合液37℃孵育1h，然后95℃变性5m功，用冰块冷却于一30C保存。PCR：将5μL反转录产物，10×TaqDNA多聚酶缓冲液，25mmol/L氯化镁，200uμmol/L三磷e)
酸脱氧核苷酸（dATP、dTTP、dCTP、dGTP），3.86mmol/Lmmol/L，60mmol/L氯化钾，12mmol/LTris-HCl(pH9.0),0.1%TritonX-100,2pmol引物80F2,2pmol引物36E2(5ACCGGGGATCCTAGGCATTT-3），0.5UTaqDNA聚合酶混合。cDNA在92C变性5min，然后设定～个40循环的PCR程序：首先92℃变性45s，然后52℃退火45s，72℃延伸45S。最末一个循环包括一个72℃5min的延伸时间。SN/T1502—2005
扩增产物检测：应用1μg/L溴化乙二胺染色，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，以123bpd）
DNA条带作为标记物。
C.4.2结果判定
紫外线照射下出现预期的特异性扩增条带（长度为340bp)为阳性。5免疫印迹
操作步骤
按下列步骤操作：
用分光光度法测定缩短的重组拉沙热病毒核蛋白的浓度，并调整至5μg/3uL、1μg/3μL、a)
100ng/3μL、10ng/3μL.用2%SDS、100mmol/LDTT、50mmol/LTris-HCl(pH6.8)将鸡溶解素（LYS）.调整至1ng/3uL.5ng/3μL。蛋白溶液在95℃孵育10min，然后保存于0℃备用。分别将1μg/3pL、100ng/3μL、10ng/3μL核蛋白以及1μg/3μLLYS分别滴在硝酰膜上，风干。IgM检测时，将5μg/3μL、1μg/3μL核蛋白以及5μg/3μLLYS点在膜条上。将膜条在室温下贮存备用，或者用铝箔袋子真空封存以便延长储存时间。膜条用TBST缓冲液于室温封闭30min。b)
为了确定最适反应条件，人血清用TBST-NFM稀释为1：100～1：400以检测IgG型抗体，稀释为1：25～1：100以检测IgM型抗体，轻微振荡孵育1.5h。用TBST洗涤膜条三次后，加入稀释度为1：500～1：2000的过氧化物酶标记免抗人IgG或IgM或抗人IgM抗体。
膜条孵育1h，再用TBST洗涤两次，用NT缓冲液洗涤一次。e）
f）将微量氯-1-萘酚作为底物加人到15%（体积分数）甲醇、75%（体积分数）NT缓冲液、0.2%H,O2中，室温孵育15min后显色。
C.5.2结果判定
膜条上有均一的色点的判断为阳性，尚能观察到的微弱的环定为阴性。9
SN/T1502—2005
D.1实验室生物安全
附录D
（规范性附录）
实验室生物安全及防护措施
D.1.1在生物安全4级（P4)实验室中进行的操作下列操作应在生物安全4级（P4)实验室中进行。在设施的工作区内，所有的工作都要限制在Ⅲ级生物安全柜或Ⅱ级生物安全柜与一套生命维持系统供气的正压防护服联合使用：一用细胞培养的方法分离病毒；收集或浓缩病毒或其培养产物；一用活病毒或病毒的全基因接种动物。D.1.2在生物安全3级（P3)实验室中进行的操作下列操作应在生物安全3级(P3)实验室或全排式生物安全柜中进行：血清和血液、其他体液、排泄物等样品的诊断检测；溶解、固定或其他方法处理灭活的病毒和（或）无传染性的病毒基因片段；—可能产生溶胶的样品处理；
一临床样品的包装、分装；
离心管和转头的封闭和开启。
D.2防护措施
D.2.1操作的人员应具备的防护措施D.2.1.1佩带N95级口罩，按照操作者鼻部尺寸调整口罩的鼻金属夹，保证做到呼出和吸人气体确实经过口罩过滤。
D.2.1.2佩带可以遮盖脸部的防护面罩或防护眼罩。D.2.1.3佩带外科手术帽，并遮盖住双侧耳部。D.2.1.4佩带两层外科手术乳胶手套。每完成一次可能接触含有病原的样品的操作后，应更换外层手套，再进行下步操作。
D.2.1.5穿着实验白大衣，在白大衣外再穿着外科手术衣或连体隔离服（最好为防水材料），双上肢佩带袖套，并用乳胶手套袖端将袖口覆盖、绷紧。D.2.1.6双下肢穿着裤套，并用鞋套上部橡皮筋将裤套下端绷紧。D.2.2操作场地与实验材料的消毒处理D.2.2.1从Ⅲ级生物安全柜或P4实验室拿出的活的或完整无损的生物材料，首先要装到一个打不破的一级容器里然后密封在一个打不破的二级容器里，最后通过消毒浸泡容器、熏蒸消毒柜（烟熏消毒舱）或专用的气锁口将该双层容器拿出实验室。D.2.2.2除活的或完整无损的生物材料外，其他材料在离开实验室之前必须高压灭菌或消毒，否则任何材料不能拿出实验室。可能被高温或蒸汽破坏的器材或材料可装在专门的气锁或消毒柜里用气体或烟雾剂消毒。
D.2.2.3所有拿出实验室的材料应经过双门高压灭菌器消毒。该实验室的高压灭菌器骑墙部分与外墙之间的缝隙是密封的，高压灭菌器的双门是自动控制的，以保证只有在高压“灭菌”已完成后向外的门才能打开。