【农业行业标准(NY)】 转基因植物及其产品食用安全检测 抗营养素 第3部分： 硫代葡萄糖苷的测定

ICS65.020.99
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 1103.3—2006
转基因植物及其产品食用安全检测抗营养素第3部分：硫代葡萄糖著的测定Safety assessment of genetically modified plant and derived productsPart 3: assay of anti-nutrients glycosinolate2006-07-10发布
2006-10-01实施
中华人民共和国农业部发布
本标准附录A为资料性附录,附录B 为规范性附录。本标准出中华人民共和国农业部提出本标准由全国农业转基因生物安全管理标准化技术委员会归川。NY/T 1103.3—2006
本标准起草单位：中国农业科学院油料作物研究所、中国疾病预防控制中心营养与食品安全所、农业部科技发展中心、中国农业大学、大津市卫生防病心。本标准要起草人：李培武、杨月欣、丁小霞、韩军花、张文、拿宁、汪其怀、黄昆仑、刘克明、刘培磊、连庆
一范围
转基因植物及其产品食用安全检测NY/'T 1103.3—2006
抗营养素第3部分：硫代葡萄糖苷的测定本标准规定了转基因油莱籽及其产品中硫代葡萄糖苗的高效液相色谱测定方法。本标雄适川丁转基因油菜籽及其产品中硫代葡萄糖者的高效液相色谱测定。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标推的引用而成为不标准的条款。凡是注月期的引用文件，随后所有的修单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用上本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究足否可使用这些文件的最新版本，凡是不注口期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB5491粮食，油料检验打样、分样法GB/T14488.1油料种籽含油量测定法GB/T14489.1油料水分及挥发物含母测定法3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。3.1
转基因油菜籽genetically modified rapeseed指利用基因工程技术改变基因组构成，用于农业生产或者农产品加工的油菜籽。3.2
转基因油菜籽产品pruducts derived frum genetically modified rapeseed指转基因油莱料的直接加工产品和含有转基因油菜籽的产品。3.3
相对校正系数
response factors此内容来自标准下载网
待测硫代葡葡糖昔的摩尔吸光系数与内标的摩尔吸光系数的相对比值，4原理
用70%甲醇水溶液提取硫代葡萄糖者，然后在阴离子交换树脂上纯化,并酶解脱去硫酸根，反相色谱柱分离，紫外检测器检测蔬代葡荐糖节：5试验材料
转基因油菜籽及基产品，受体抛菜籽及其产品：如果对转基因池菜籽产品中的蔬化葡药糖进行测定，转基因油菜籽产品和受体油菜籽产品的处理条件成相同上述材料的水分含量和种植环境应基本致。6试剂
除非另有说明，仅使用分析纯试剂;水为蒸馏水。6.1硫酸酯酶溶液：Hetibomatia111型（Fc3.1.6.1）,每毫升硫酸酯酶溶液的活性单位不低}-0.51
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硫酸酯酶溶液应仰配抑用、
6.2葡聚糖凝胶悬浮液：称取10gDEAESephadexA25葡聚糖凝胶，浸泡在过量的2mol/L醋酸溶液中，静置沉淀，所删入2mrl醋酸溶液，直到液体体积是沉淀体积的2倍，于4℃冰箱中存放,得用6.370%甲醇溶液：取70mL甲醇，加水定容至100mL。6,40.02 mol/醋酸钠溶液：称取0.272g醋酸钠(CH;CO0Na-3H,O),加入800mL水溶解,用醋酸调节溶液的pH至4.0,加水定容至1L6.56mol/l.甲酸咪唑溶液：称取204g咪唑，溶解于113mL甲酸中，待溶液冷却后加水定容至500mLo
6.6内标：用丙烯基硫代葡翻糖苷（Mr=415.49)作内标，当样品中含有丙烯基硫代葡萄糖时,用苯甲基硫代葡萄糖者（Mr一447.52）作内标。对硫代葡萄糖苷含量低于20.0umol/g的样品，可将下述6.6.1至6.6.4中的内标溶液浓度降为1mmol/L至3mmol/内标溶液在4C的冰箱中可存放3周，在一18C条件下可保存更长时间，内标溶液的纯度检定参见附录A，6.6.15mmol/.丙烯基硫代葡糖苷溶液：称取207.7mg丙烯基硫代葡萄糖香溶解于80mL水中，加水定容岔100mL
6.6.220mmol/L丙烯基硫代葡萄糖苷溶液：称取831.0mg丙烯基硫代葡萄糖自溶解于80mL水中，加水定容至100mLc
6.6.35mmol/.米甲基硫代葡萄糖苷溶液：称取223.7mg苯甲基硫代葡萄糖苷溶解于80mL水中，加水定容至100mL。
6.6.420)mmol^.苯丹基硫代葡萄糖苷溶液：称取895.0mg苯甲基硫代葡萄糖苷溶解于80mL水中，加水定容至100mL。
6.7流动相A：超声波脱气30s的水。6.8流动相B：取200mL色谱级艺睛，加人800mL水，混匀，超声波脱气30s7仪器和设备
7.1通常实验室仪器设备，
7.2研钵或微型研磨机。
7.3聚丙烯离子交换微柱：底部筛板为100目。7.4离心机：带有10mL转头，并能获得5000g的相对离心力。7.50.45mm水溶性微孔滤膜。
7.6色谱柱：填料颗粒小丁或等丁10μm的反相Cis或Cg柱，例如：NovapakCjg柱，5μm(150mm×3.9nim);Lichrosrb Rpl8 柱:,5 μm(150 mm × 4.6 mm); $Spherisrb (g柱,10 μm(150 mm × 4 mm);LichrospherRp8柱,5μm(125mm×4mm)。7.7高效液相色谱仪：具备梯度洗脱，柱温可控制在30℃，带紫外检测器，8试样的制备
按照（GB5491的规定对试验材料进行缩分，将缩分后的试验材料分成3等份。第-份按GB/T14489.1的规定测定水分及挥发物含量，第二份按（GR/T14488.1的规定测定含油量，第二份为硫代葡萄糖苷待测试样。
如果试验材料的水分及挥发物含量超过10%，应在45℃条件下通风燥，并将干燥后的待测试样在微型粉碎机中粉碎，过40国筛，然后立即连续完成9.1和9.2。2
9操作步骤
9.1称样
分别称取200.0mg待测试样至A、B两支离心管中。9.2硫代葡萄糖苷的提取
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9.2.1将离心管75℃水浴1min，加人2mL.70%沸甲醇溶液后，立即加人200L5mmol/内标溶液至A管中,200 uL 20 mrnol/1.内标溶液至 B管中。9.2.275℃水浴10min，其间每隔2min取出离心管在旋涡混合器上旋涡混合，然后取出离心管冷卸至室温，5000离心3min,分别转移上清液至10mL刻度试管AB中9.2.3分别向A、B管中再加入211L70%沸H醇溶液,75℃水浴约30s,旋涡混勾后，75%:水溶10min.其间每隔2min取出离心管旋涡混合，然后取H离心管冷却至室温，5000g离心3min,分别转移上消液至原刻度试管A'、B'。
9.2.4水调节A、B管中的提取液至5mL，混勺。此提取液在18℃暗处可保存2周。9.3离子交换微柱的制备
每一个试样提取液准备一支聚丙烯离子交换微柱，垂直置于试管架上。取0.5mI充分混勾的葡聚糖凝胶悬浮液至每一离子交换微杠:中,注意不要使悬浮液粘附在柱壁。静置待液体排干斥,取2 mL6mal/.甲酸咪噬溶液冲洗树脂，排十后，再用1mL水冲洗树脂两次，每次均让水排下。9.4纯化、脱硫酸根
9.4.1取1mL提取液缓缓加入已制备好的离予交换微柱中，注意不能搅动树脂表而，待液体排干后，分别加人1ml.0.02mol/L醋酸钠溶液两次，每次加入后均让液体排十。9.4.2加人100证硫酸酯酶辫液至离了交换微柱，35条件下反应16h。9.4.3分别用1ml.水冲洗离了交换微柱2次，洗脱液收集于试管中，9.4.4用水将洗脱液定容至5rnL，充分溉勾后，用0.45m的微孔滤膜过滤，待进样。洗脱液在一18℃暗处可存放1周。
9.5空白试验
用相同的样品进行相同的前处理，但不加内标物质，以检定样品中内标物质是否存在。9.6色谱条件
9.6.1仪器条件：流动机流速为1.0mL/min，柱温30，紫外检测器检测波长229nm。9.6.2洗脱梯度
9.6.2. 1 对 Sphcrisrb C柱, 10 μm(150 mm × 4 mm)和 Novapak Ci柱,5 μm(150 mm × 3.9 mm),洗脱梯度见表1。
表1Spherisorb Ci柱和NovapakCi柱洗脱梯度时间
10 min
15 Tril
20 rmin
流动相A(%）
9.6.2.2 对 Lichrosorb RP18柱,5 um(150 mtr× 4.6 rrm),洗脱梯度见表2.流动相 B(%)
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25 min
30 min
表 2 Lichrosorb RP18 柱洗脱梯度溉动相A(%)
9,6.2.3对LichrospherRP8柱.5μtn(125rrm×4mm）,洗脱梯度见表3。表3LichrospherRP8柱洗脱梯度
O nain
20 min
27 min
9.7色谱测定
进样量 10 μL,记录峰[而积。
10结果表示
10.1单组分硫代葡萄糖营含量的计算流动相A（%）
流动相B（%）
流动相 B(%)
10.1.1以每克干基脱脂油菜籽中所含硫代葡萄糖苷的微摩尔数表示,按式(1)计算：Ag×n×Kg×
式中：
干基脱脂油菜籽中硫代葡萄糖苷含量，单位为微摩尔每克（iumol/g）：脱硫硫代葡萄糖苷峰面积；
内标峰面积；
脱硫硫代葡药糖苷刘校正系数，按附录B的规定：试样质量，单位为克（g）；
试样中加人内标的量，单位为微摩尔（umol)；w—试样中水分、挥发物和含油量之和,以质量百分数表示(%）。计算结果表示到小数点后两位。(1)
10.1.2以每克脱脂油菜籽含标准水分及挥发物时所含硫代帮糖节的微摩尔数表示，按式(2)计算：D2-
AgAs、n、m、Kg、 同式(1);
Ag×n×Kg×i-u
×(1 - Ws)
-脱脂油菜籽含标准水分及挥发物时硫代葡萄糖首的含量，单位为微摩尔每克（umol/g)；(2)
Ws-标推水分及挥发物含量，以质量百分数表示，数值为8.5%或9%计算结果表示到小数点后两位。10.1.3以每克干基油菜籽中所含硫代葡糖并的微摩尔数表示,按式（3)计算：D3-
式中：
Ag、As、nm.Kg 同式(1);
A××Kg×et
1)3—一干基渊菜籽中硫代葡萄糖苷含量，单位为微尔每克（)/g）：t——试样中水分及挥发物含量，以质量百分数表示（%）。计算结果表示到小数点后两位。NY/T 1103.3—2006
10.1.4以每克油菜籽含标准水分及挥发物时所含硫代葡萄糖苷的微摩尔数表示，按式(4)计算：Ag×n× Kg×i- un
X(lWs) -
式中：
Ag、As、n、n、Kg、twt、Ws 国式(1)、(2)和(3);D4一一油菜籽含标准水分及挥发物时硫代葡萄糖苷的含鼠,单位为微摩尔每克(umol/g)。计算结果表示到小数点后两位。10.2硫代葡萄糖苷含量的计算
硫代葡萄糖苷含量等于单组分硫代葡萄糖甘（单组分峰面积应大于峰面积总和的1%）含量的总和，以每克样品中所含硫代葡菊苷的微摩尔数表示。如果A,B两管硫代葡葡糖苷含量的测定值满足11中允许差的要求，硫代葡萄糖节的含量为两测定值的算术平哟值，计算结果表示到小数点后两位11充许差
11.1同一试样、同-方法、同-操件者、同-仪器、同--实验室短期内两次测定值充许差：如果硫代葡葡糖苷含量低于20.00umol/g，允许差不大于2.00umol/g；如果硫代葡魏糖节含量在20.00umol/g～35.00μmol/g范调内，允许差不大于4.00μmol/g；如果硫代葡萄糖者含量大于35.00mmol/g，充许差不大于6.00μmol/g。
11.2同一试样、同一方法、不同操作者、不同仪器、不同实验室两次测定值充许差：如果硫代葡萄糖苷含量低于20.00umol/g，充许差不大4.00μmol/g；如果硫代葡葡糖节含量在20.00umol/g~35.00umol/g范围内，允许差不大于8.00μmol/g；如果硫代葡萄糖苷含量大于35.00umol/g，允许差不大于12.00 μmol/go
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A.1检定方法
内标纯度的检定方法主要包括：附录A
(资料性附录)
内标纯度的检定
月本标准规定的方法进行高效凝相色谱分析。用高效液相色谱的离了对技术分析完整的内标(不脱硫酸根的内标)。一月气相色谱分析脱硫酸盐利硅烷化的内标。-用齐子酶（EC3.2.3.2)水解内标，根据水解产物葡萄糖的浓度检定内标的纯度。A.2结果分析
如果用色谱方法检定内标纯度，当色谱图中主峰面积不小于总峰面积的98%时，表明内标纯度符合本标谁要求
如果用酶水解方法检定内标纯度，当水解产物葡萄糖的摩尔浓度不小于内标摩尔浓度的98%时，表明内标纯度符合本标准要求。6
附录B
规范性附录
相对校正系数
表 B.1脱硫硫代葡萄糖苷的相对校正系数硫代葡葡椭苷名称
2-羟基-3-丁烯基脱硫硫代葡萄糖苷反式2-羟素-3-厂烯基脱硫硫代葡萄糖者内烯基脱硫硫代葡萄糖苷
4-甲亚砜丁基悦硫硫代葡药糖背2-羟基-4-戊烯基脱硫硫状葡萄糖甘5-中亚研戊基脱疏硫代葡需糖苷3-T基脱硫硫代葡萄糖凸
4羟苯3嗪甲基脱硫硫代葡萄糖苷4-戊烯基悦硫硫代葡萄糖片
苯甲基(苯基)脱硫硫代葡萄糖
3-晰哚甲基脱硫硫代葡剂糖苷
苯艺基脱毓硫代衡萄糖芒
4-甲氧基-3-吲哚甲基脱硫硫代葡截糖苷1-甲氧基-3-响哚甲基脱硫硫代葡药苷其他
Desulfoprogoitrin
Desulfoepi-progoizrir
Desulfosinigrin
Deulrnglhurx raphanin
Desulfogluconapaleilerin
Desulfogluxxlyssin
Desulfoglaconapin
Desulfcr4-nydirxyglucobrassicinLesullogluxohrasicanapin
Dxsulfoglucotropacolin
Desulleglucsbrasicin
Dxsulfegluounasturtin
Tesulfc-4-methoxyglucobrassicinDesulene gluxbrsicin
COrher desulfogluensinolatesNY/T 1103.3—2006
和对校止系数（Kg）
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2006年9月第1版
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