【农业行业标准(NY)】 动物棘球蚴病诊断技术

ICS11.220
中华人民共和国农业行业标准
NY/T1466—2007
动物棘球病诊断技术
Diagnostic techniques for animal echinococcosis2007-12-18发布
2008-03-01实施
中华人民共和国农业部
本标准的附录A、附录B和附录C，均为规范性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中国农业科学院兰州兽医研究所。本标准主要起草人：贾万忠、田广孚、才学鹏。NY/T1466--2007
1范围
动物棘球坳病诊断技术
NY/T1466—2007
本标准规定了用于绵羊和牛棘球蜘病间接血球凝集试验（IHA)和酶联免疫吸附试验（ELISA）两诊断方法的要求。
本标准用于检测血清抗体，适用于绵羊和牛棘球病大批量样品的普查，包括棘球蜘病的流行病学调查、动物生前诊断和检疫。
2间接血球凝集试验（IHA)
2.1材料
2.1.1待检样品的采集和处理
采集动物血清作为检测材料。加NaN（终浓度0.01%)或硫柳汞（终浓度0.01%）防腐。4℃冷藏保存。
2.1.2囊液采集与处理
以无菌方法从直径在3cm以上含有棘球幼育囊的包囊中抽取囊液，采集多个包囊的囊液混合后使用。囊液应清亮，呈无色或淡黄色。4℃，3000r/min离心20min；取上清液，4℃用40%的聚乙二醇（分子相对质量8000～20000）浓缩10倍；再用无离子水和生理盐水交替透析48h充分除盐；4℃，3000r/min离心20min；取上清液，用紫外吸收法测定蛋白含量，调整浓度为5mg/mL；加NaN，（终浓度为0.01%），分装后一20℃保存备用。2.1.3阳性参考血清制备
用棘球蜘囊液抗原免疫羊和牛制备，血清抗体的IHA效价为1：1024~1：4096。2.1.4阴性参考血清制备
健康羊、牛血清，抗体IHA效价在1：16以下。2.1.5IHA诊断液制备
制备方法见附录A。
2.1.6：微量反应板
72孔12×6或96孔（12×8）V型。2.2操作方法
2.2.1试验设置
将血凝板的一行或两行作为对照孔，其余各行为加样孔。2.2.2稀释血清和加样
用pH7.2、0.15mol/LPBS稀释液将待检样品按4倍系列稀释为1：4、1：16、1：64和1：256四个滴度，每个滴度在加样孔各加1孔。阳性参考血清按4倍系列稀释为1：4、1：16、1：64、1：256、1：1024、1：4096和1：16384共7个孔，加至对照孔；阴性参考血清稀释同待检血清，加至对照孔。稀释液对照孔只将稀释液加1孔至对照孔。每孔加样量均为25。2.2.3加诊断液
各孔加IHA诊断液，加样量每孔25uL。2.2.4血凝反应
试验微量板置振荡器上振荡1min～2min，使诊断液中的血球分布均匀，从振荡器上取下，用干净NY/T1466-2007
的玻璃板盖住反应板，放室温(18℃~25℃)反应2h~3h。2.3结果判定
2.3.1试验成立条件
当稀释液对照不出现凝集，阴性参考血清不高于1：16和阳性参考血清抗体效价为产品规定值(1：1024～1：4096)三项条件同时满足时，试验成立。2.3.2判定
“十十十十”100%的血球在孔壁下形成呈均质膜样凝集。边缘整齐，致密。“+十+”75%的血球在孔壁下形成呈膜样凝集，不凝集的血球在孔底中央集中成很小的圆点。“+十”50%的血球在孔壁更下部形成呈稀疏凝集，不凝集的血球在孔底中央集成较大圆点。“十”25%的血球在孔底凝集，不凝集的血球在孔底中央集中成大圆点。“”所有血球均不凝集，并集中于孔底中央成最大的圆点。2.3.3阳性判定标准wwW.bzxz.Net
使用V型板，以“十十”为阳性终点。待检样品抗体滴度等于或高于阳性规定值（1：64)时，判定为阳性；待检样品抗体滴度低于1：64即第三孔（1：64稀释)为十”或“-”者，判定为阴性。3酶联免疫吸附试验(ELISA)
3.1材料
3.1.1动物血清样品的采集和处理同2.1.1。
3.1.2抗原
为醋酸盐纯化抗原。
3.1.3阳性参考血清
同2.1.3。
3.1.4阴性参考血清
同2.1.4。
3.1.5试验溶液
详见附录B。
3.1.6抗免疫球蛋白一酶结合物
可从生化试剂公司购买，也可自行制备（详细方法见附录C)。3.1.7微量反应板
40孔或96孔聚苯乙烯微量酶标板。3.2操作方法
3.2.1抗原包被
用包被缓冲液将抗原稀释至工作浓度（1ug/mL～10μg/mL），每孔加100μL。空白对照孔加100μL包被缓冲液（无抗原），4℃过夜。3.2.2洗涤
试验开始先洗涤包被的ELISA板，弃孔内包被液，拍于。用洗涤缓冲液洗3次，每次各孔加满洗涤缓冲液后停留3min，甩干。洗涤3次后，在吸水纸巾上拍干。3.2.3封闭
每孔加封闭缓冲液100μL，置37℃封闭1h。弃孔内封闭液，洗涤3次，方法同上。3.2.4加待检血清
NY/T1466—2007
用洗涤缓冲液将待检样品和参考血清稀释至规定工作浓度（1：100)后各加2孔，酶结合物对照孔和空白对照孔加稀释缓冲液各1孔。加样量均为100uL，37℃温育1h。弃孔内血清稀释液，洗涤3次，方法同上。
3.2.5加抗免疫球蛋白一酶结合物检测牛、羊动物血清样品，应使用相应动物种类的抗免疫球蛋白一酶结合物。用稀释缓冲液稀释至工作浓度（1：400~1：1000或者按试剂盒产品说明），每孔加100L，37℃温育1h。洗涤3次，方法同上。
3.2.6显色
加底物缓冲液，每孔100μL，37℃温育30min。3.2.7终止反应
加50μuL终止液，振荡混匀，静置5min后，用酶标仪读取每孔492nm波长处的光吸收值（OD492值)。
3.3判定
3.3.1计算
计算出每份待检样品两孔的平均OD值（P)，再除以同板参考阴性血清两孔的平均OD值（N)，则得出每份待检样品的P/N值。
3.3.2结果判定
试验成立的条件：若酶结合物对照OD值小于0.1阳性参考血清OD值在1.0土2SD范围，且P/N值大于2，则试验成立，结果有效。凡待检样品的P/N≥2，则判定该样品为阳性；P/N<2，则为阴性。NY/T1466——2007
A.1红细胞的采集
附录A
（规范性附录）
IHA诊断液制方法
无菌采集健康公绵羊血，与等体积Alsever氏液混勾，4℃冰箱内稳定3d～5d最好在1周内使用，不超过2周）。将全血经双层纱布过滤，3000r/min离心10min（4℃），弃上清液。沉淀用灭菌pH7.2、0.15mol/LPBS离心洗涤4次(方法同前)后，仍用相同的PBS配成5%红细胞悬液。A.2红细胞的醛化
取红细胞悬液，按1：5比例逐滴加入2.5%戊二醛，用微型电动搅拌机缓慢搅拌，加完后继续在室温搅拌1h。4℃3000r/min离心5min，弃上清液，沉淀用pH7.2、0.15mol/LPBS离心洗涤4次。将红细胞积压后，用同样的PBS配成5%的悬液。A.3红细胞的赣化
量取一定量的5%红细胞悬液，与等体积的酸溶液混合，置37℃恒温水浴箱温育30min，其间轻摇数次。4℃3000r/min离心5min，沉淀用pH7.2、0.15mol/LPBS离心洗涤4次后，配成2%悬液。A.4红细胞的致敏
量取一定量的悬液，加等体积的抗原溶液，混匀，37℃水浴30min，其间轻摇数次。3000r/min离心5min，沉淀用pH7.2、0.15mol/LPBS离心洗涤4次。沉淀用1%健康兔血清稀释为1%的悬液，即为IHA诊断液。同时，在相同条件下制备一部分未经致敏的红细胞悬液作为非致敏对照血球。A.5保存
4℃可保存半年。或者制成冻干抗原：用冻干血球保存液制成10%致敏红血球悬液，分装，冻干，4℃保存。
A.6溶液配制
A.6.1Alsever氏液
葡萄糖
柠檬酸
柠檬酸钠
加水至1000mL，微加热溶解后过滤。在1.034×105Pa(15Ibf/in2）高压下灭菌20min，置4℃保存，可用1周。
A.6.2pH7.2、0.15mol/LPBS
NazHPO4·12H20
NY/T1466—2007
加水至1000mL。在1.034×105Pa(15lbf/in2）高压下灭菌20min，4℃保存备用。A.6.3赣酸溶液
操酸必须为优质纯品，用双蒸馅水配成1/200溶液，置4℃冰箱内保存，1周内使用。临用前，用pH7.2.0.15mol/LPBS稀释为1/20000溶液。A.6.41%健康免血清
兔血清（56℃30min灭活）
pH 7.20.15 mol/LPBS
临用前配制。
A.6.5冻干血球保存液
免血清（56℃30min灭活）
加pH7.2、0.15mol/LPBS至100mL，临用前配制。NY/T1466—2007
附录B
（规范性附录）
ELISA溶液配制
B.1抗原包被液（pH9.6、0.05mol/L碳酸盐缓冲液）NazCO3
NaHCO3
加水至100mL，4℃保存备用。
B.2洗涤缓冲液(0.01mol/LpH7.4PBS-0.05%Tween20,PBST)NaCl
Na HPO.·12H0
Tween-20
加水至1000mL，置4℃保存备用。8.0g
B.3封闭缓冲液(0.2%Tween20mol/L~0.01mol/L,pH7.4PBST)Tween-20
加洗涤缓冲液100mL，置4℃保存备用。B.4抗免疫球白一酶结合物稀释液0.20mL
同B.2洗涤缓冲液。或者用1%BSA-0.05%Tween20-pH7.40.01mol/LPBST。在检测牛血清时，抗免疫球蛋白一酶结合物稀释液只用洗涤缓冲液。BSA(牛血清白蛋白）
加洗涤缓冲液
置4℃保存备用。
B.5底物溶液
B.5.1.磷酸盐—柠橄酸缓冲液(pH5.0）0.2mol/LNazHPO4
0.1mol/L柠檬酸
临用前配制。
B.5.2底物溶液
磷酸盐一柠檬酸缓冲液
邻苯二胺
30%H02
临用前配制。
B.6终止液(2mol/LHSO,)
浓硫酸
NY/T1466—2007
NY/T1466—2007
C.1抗免疫球蛋白(IgG)制备
C.1.1健康动物血清的来集
方法同IHA（见2.1.4)。
附录C
（规范性附录）
抗免疫球蛋白-酶结合物的制备方法C.1.2IgG的分离和纯化
先用硫酸铵盐析法初步提取IgG，再用DEAE-32或DEAE-22纤维素进一步进行纯化。C.1.3抗IgG血清的制备：
选择健康雄性家免，采用常量注射法进行免疫。取纯化的IgG（20mg/mL）溶液加等量弗氏完全佐剂，乳化后采取多点皮下和肌肉注射抗原，总量0.5mL1mL。3周后，用同剂量弗氏不完全佐剂抗原再注射一次，方法同上。2周后，用同剂量的抗原溶液免疫一次，方法同上。2周后，用同剂量的抗原溶液免疫一次，静脉注射。末次注射后1周采血检验，抗体滴度达到要求后采集血液，分离血清。C.1.4抗IgG血清效价测定
采用双向琼脂扩散试验。琼脂浓度为1%~1.5%，中心孔IgG蛋白浓度为1mg/mL~2mg/mL。免疫免血清作倍比稀释。将琼扩效价在1：32以上的血清混合，一20℃或一70℃处保存备用。C.1.5抗IgG的分离和纯化
方法同C.1.2IgG的分离和纯化。C.2过碘酸钠法标记辣根过氧化物酶(HRP)与抗IgG复合物C.2.1称取5mgHRP(RZ>3.0)溶于新鲜配制的pH8.1、0.3mol/L碳酸氢钠1.0mL。C.2.2加1%FDNB(氟二硝基苯）无水乙醇溶液0.1mL，室温轻轻搅拌1h。C.2.3加0.06mol/LNaIO，1.0mL，室温下轻轻搅拌30min，溶液呈现黄绿色。C.2.4加0.16mol/L乙二醇1.0mL，室温轻轻搅拌1h。C.2.5在4℃下，对pH9.5.0.01mol/L碳酸盐缓冲液充分透析，将酶溶液体积调整至3.0mLC.2.6将5.0mg抗体溶于pH9.5.0.01mol/L碳酸盐缓冲液1.0mL中，然后加人酶溶液中，室温下轻搅拌2h。
C.2.7加5mg硼氢化钠，放置4℃，过夜。C.2.8置pH7.2、0.01mol/LPB-0.14mol/LNaCI溶液中透析，离心以除去可能形成的沉淀。C.2.9用SephadexG-200层析纯化。C.2.10加BSA至1%，与等量中性甘油混合后分装，置一20℃保存。C.3改良过碘酸钠标记法
C.3.1在1mL双蒸水中溶解HRP4mg，加新鲜配制的0.1mol/LNaIO,0.2mL，室温下轻轻搅拌20min。
C.3.2在pH4.4、1mmol/LNaAC-HAC缓冲液透析过夜（4℃)，中间换液1次。8
NY/T1466—2007
C.3.3加pH9.5、0.2mol/L碳酸盐缓冲液20μL，加入免疫球蛋白1mL(8mg溶于pH9.5、0.01mol/L碳酸盐缓冲液1mL），室温下搅拌2h。C.3.4加0.1mL新鲜配制的硼氢化钠溶液（4mg/L)，置于4℃，过夜。C.3.5加等量饱和（NH）,SO，溶液，4℃放2h后，3000r/min离心30min，沉淀用5%饱和度的(NH4）2SO溶液洗涤2次后溶于pH7.2、0.02mol/I.PBS中。C.3.6经SephadexG-25层析柱脱去（NH）2SO4。C.3.7加BSA至1%,与等量中性甘油混合后分装，置一20℃保存。C.4酶标记抗体的定量与克分子比值测定将酶标记抗体分别于403nm和280nm波长处测OD值（光程1cm），按下列公式计算：酶量（mg/mL)=OD403X0.4
IgG量（mg/mL)=(OD28o-OD403X0.42)X0.94X0.62克分子比值=酶量×4/IgG量
标记抗体克分子比值应为1～2。
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