【农业行业标准(NY)】 丝状支原体山羊亚种检测方法

ICS11.220
中华人民共和国农业行业标准
NY/T1468—2007
丝状支原体山羊亚种检测方法
Methods for Detecting Mycoplasma mycoides subsp. capri2007-12-18发布
2008-03-01实施
中华人民共和国农业部
NY/T1468-2007
世界动物卫生组织[WorldOrganizationforAnimalHealth（英），OfficeIntentionaldesEpizootic（法），OIE编写的《陆生动物诊断试验和疫苗手册》（第五版，2004）中，山羊接触传染性胸膜肺炎的病原为山羊支原体山羊肺炎亚种（Mycoplasmacapricolumsubsp.caripneumoniae，Mccp）。在本标准中，山羊接触传染性胸膜肺炎的病原是丝状支原体山羊亚种（PG）。虽然病原不同，但其诊断技术标准同步。
本标准附录A、附录B、附录D和附录I均为资料性附录；附录C、附录E、附录F、附录G和附录H均为规范性附录。
本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中国农业科学院兰州兽医研究所。本标准主要起草人：逐忠新、储岳峰、赵萍、高鹏程。1范围
丝状支原体山羊亚种检测方法
本标准规定了丝状支原体山羊亚种病原学和血清学诊断方法要求。本标准适用于由丝状支原体山羊亚种引起的山羊接触传染性胸膜肺炎的诊断。2病原学检查
2.1材料准备
2.1.1培养基
NY/T14682007
20%马血清马丁肉汤；20%马血清马丁琼脂；葡萄糖酵解培养基；精氨酸水解培养基；磷酸酶培养基（BPh）；凝固血清消化培养基（Sd)；菌膜、菌斑形成试验培养基。制备方法均参见附录A(A.1~A.7)。
2.1.2试剂
NET缓冲液（参见附录B.1）、TAE电泳缓冲液（参见附录B.2)；十二烷基硫酸钠（SDS)、RNaseA、蛋白酶K、酚氯仿一异戊醇（25：24：1）、无水乙醇、TaqDNA聚合酶、10×PCRbuffer（含Mg2+）、脱氧三磷酸核苷酸混合液（dNTPs）、のX174-HaeⅢdigestDNA分子质量标准、琼脂糖、溴化乙锭、灭菌双蒸水。2.1.3引物
Pcl5'-TATATGGAGTAAAAAGAC-3
Pc25'-AATGCATCATAAATAATTG-3
Pc35'-TTAATAAGTGTGTATATGAAT-3Pc45'-ACTGAGCAATTCCTCTT-3
引物在使用时用灭菌双蒸水稀释为25μmol/L~50umol/L。2.1.4其他材料
2.1.4.1兔抗支原体血清（ra-m)、健康兔血清（NRS)，制备方法见附录C。2.1.4.2抗兔免疫球蛋白荧光抗体（a-rIg-FITC)。2.1.4.3灭菌器械（剪刀、镊子、吸管、青霉素瓶等）。2.2病料采集
2.2.1活体病料采集：将棉拭子伸人待检山羊鼻腔内采集分泌物，放人无菌试管中立即送往实验室供分离。
2.2.2剖检病料采集：采集肺病变部、特别是硬变部位和非硬变部位的交界处的样品以及胸水和纵隔淋巴结。
2.2.3样品运送：采集的样品，应在4℃条件下24h内送到实验室。如果不能立即进行微生物学检查，可将样品或整个肺置一20℃冷冻保存1个～2个月。2.3病原分离
样品拭子悬浮于2mL～3mL20%马血清马丁肉汤中。组织样品用剪刀剪碎，每1g加20%马血清马丁肉汤9mL，强烈震荡；或在培养基内捣碎。胸水、组织悬液或拭子均需用20%马血清马丁肉汤做3个10倍系列稀释，稀释到10-4。将样品的各稀释液分别接种于20%马血清马丁肉汤和琼脂培养基，培养皿用胶布封口，置37℃培养5d～7d，每天观察一次。如未见生长，可按上述方法连传3NY/T1468—2007
2.4病原鉴定
2.4.1培养特征
2.4.1.1培养性状和菌落形态
阳性样品在20%马血清马丁肉汤中培养4d～5d后，呈轻度混浊带乳光样纤细菌丝生长，无菌膜，无沉淀，无颗粒悬浮。在马丁琼脂斜面或平板上生长迟缓，生长的菌落与微小的水滴相似（露滴状透明菌落），用放大镜仔细观察，可见大小悬殊且不很圆整的圆形或椭圆形菌落，中央乳头状突起明显（煎蛋状）。菌落直径0.3mm~0.5mm。2.4.1.2染色镜检
以细菌培养物抹片，用姬姆萨氏染色法（参见附录D）染色、镜检。呈淡紫色细小的球状、双球状、弧状等多形态。直径125nm～250nm。2.4.2生化特性
2.4.2.1糖酵解试验：从琼脂斜面上挑取少量待检菌培养物，接种于糖发酵管（参见附录A.3）培养液内，置37℃温箱内培养5d～7d。水解葡萄糖产酸时，颜色变黄。2.4.2.2精氨酸水解试验：将待检菌培养物接种于精氨酸水解培养基（参见附录A.4)，于37℃温箱内培养5d～7d。水解精氨酸时，颜色变红。2.4.2.3磷酸脂酶活性测定：将待检菌培养物接种于磷酸酶平板培养基（参见附录A.5），在琼脂表面滚动，当接种液体吸收后，于37℃温箱内培养7d。接种平Ⅲ和对照平血用5mol/LNaOH淹没琼脂表面，半分钟后在接种面中间和周围出现红色者为阳性反应。2.4.2.4凝固马血清液化试验：将待检菌培养物用同一铂金环接种两支凝固血清消化培养基（参见附录A.6）小管，一支用未稀释培养物，一支用10-3稀释的培养物，于37℃温箱培养。在14d内隔日观察，生长旺盛时表面液化成一个浅的下降面，凹部呈液状；生长更扩展时，可见有一个小洞；严重液化时，液体积累在斜面和管壁的角落里。2.4.2.5菌膜、菌斑形成试验：在琼脂培养基上进行（参见附录A.7)。取1滴待检菌培养物在琼脂表面滚动，当接种液体吸收后，于37℃温箱培养。在14d内隔日观察，阳性反应者在琼脂表面由于含钙、镁的皂类和类脂质沉积形成一层闪光的有显著皱纹的薄膜；同时，在陈旧菌落周边形成黑色斑点。
2.4.2.6毛地黄皂武的敏感性测定：在20%马血清马丁琼脂培养基上进行（参见附录A.2)。取1滴待检菌培养物在琼脂表面滚动；当接种液体吸收后，把毛地黄皂贰圆纸片（制备方法参见附录E）放在接种面中心，于37℃湿环境下培养，菌落出现后观察结果，在低倍镜下计量纸片边缘到抑制带外缘的距离。达到2mm或2mm以上时判为阳性反应。2.4.2.7被检菌生化特性测定：凡能水解葡萄糖，不水解精氨酸，磷酸酶活性测定阴性，血清液化试验和毛地黄皂敏感性测定阳性，菌膜、菌斑形成试验阴性者，即可初步判为丝状支原体山羊亚种。
2.4.3表面荧光抗体试验（间接法）2.4.3.1将兔抗支原体血清或健康兔血清（对照用），用生理盐水或pH7.2磷酸盐缓冲盐水（PBS）适当稀释，取1滴覆盖于菌落未固定的琼脂块（制备方法参见附录F）的整个表面。兔抗支原体血清的稀释度，是根据兔抗支原体血清与异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗免免疫球蛋白（a-rIgFITC）作棋盘式滴定来确定。
2.4.3.2将带琼脂小块的载玻片放人湿盒，置室温（20℃）下孵育30min。2.4.3.3分别将每块载玻片上全部琼脂块移入含约7mLPBS的10mL试管中。2
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2.4.3.4试管加塞以18r/min～30r/min旋转震荡10min，弃去PBS，加人新鲜PBS，再离心10min。
2.4.3.5弃去PBS，分别把琼脂小块菌落面朝上，放在载玻片上，吸去多余水分。2.4.3.6取1滴适当稀释的a-rIg-FITC将琼脂块覆盖。a-rIg-FITC的工作稀释度根据与兔血清反应的棋盘式滴定来确定，取荧光最强、背景最暗的最高稀释度作为最适稀释度。2.4.3.7把琼脂小块放入湿盒中，置室温（20℃）孵育30min，移到含有新鲜PBS试管中，如前离洗2次。
2.4.3.8重新把琼脂小块菌落面向上，分别放到载玻片上，用免疫荧光显微镜观察特异性荧光强度。一般可用“+”表示：（一）无荧光；（士）极弱的可荧光；（十）荧光明亮；（十十～十+十+）荧光闪亮。待检菌特异性荧光强度达“十”以上，而各种对照显示为（土）或（一），即可判定为阳性。2.4.4聚合酶链反应（Polymerasechainreaction，PCR）2.4.4.1样品DNA的提取
2.4.4.1.1样品处理
1）鼻腔分泌物：将鼻拭子浸入1mLNET缓冲液中30min，反复挤压，将浸出液经13000r/min离心20min后，弃上清液，收集沉淀。2）组织：将病变肺组织和纵隔淋巴结剪成小块，按1g加入0.9mLNET缓冲液研磨后，3000/min离心10min，取上清液。13000r/min离心20min后，弃上清液，收集沉淀。3）胸水：取500山胸水加人500LNET缓冲液，混匀后，13000r/min离心20min，弃上清液，收集沉淀。
2.4.4.1.2DNA的提取方法wwW.bzxz.Net
向2.4.4.1.1收集的沉淀中加人600uLNET缓冲液。加人100L10%的SDS溶液（终浓度1.5%），混匀。在95℃～100℃孵育10min后，迅速放置于冰上冷却10min～15min。
在样品中加人RNaseA至终浓度为40μg/mL，50℃作用30min。然后加人蛋白酶K至终浓度为200μg/mL，50℃作用30min。
加入等体积的酚一氯仿一异戊醇（25：24：1），手颠倒摇勾2次～3次，4℃7000r/min离心10min。
转移上清液于另一离心管中。
重复一次（4）、（5）的操作过程，加人2.5倍体积的4℃下预冷无水乙醇，一20℃沉淀30min，12000r/min离心10min，弃去上清液。用1mL70%乙醇漂洗，重复2次～3次，12000r/min离心2min。真空或室温干燥，DNA沉淀用25μL无菌双蒸水溶解作为模板，一20℃保存备用。2.4.4.2PCR反应体系
第一次扩增：10XPCRbuffer（含Mg2+）d NTPs
模板（被检样品总DNA）
灭菌双蒸水
TagDNA聚合酶
第二次扩增：10xPCRbuffer（含Mg2+）dNTPs
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模板（一扩产物1：100稀释）
灭菌双蒸水
TaqDNA聚合酶
样品检测时，同时要设阳性对照和空白对照。阳性对照模板为丝状支原体山羊亚种Pc1-Pc2基因片断重组质粒，空白对照为灭菌双蒸水。2.4.4.3PCR反应程序
第一次扩增：95℃变性5min，然后30个循环，分别为：94℃变性50s；46℃退火50s；72℃延伸50s。最后72℃延伸10min，4℃保存。第二次扩增：95℃变性2min，然后30个循环，分别为：94℃变性30s；46℃退火30s；72℃延伸30s。最后72℃延伸6min，4℃保存。2.4.4.4电泳
PCR反应结束，取第二次扩增产物各5μL（包括被检样品、阳性对照、空白对照）、①X174-HaeⅢdigestDNA分子质量标准5μL进行1%琼脂糖凝胶（制备方法参见附录B.3）电泳，并用凝胶成像仪观察、拍照，记录试验结果。2.4.4.5结果判定
在同一块凝胶板上电泳后，X174-HaeⅢdigestDNA分子质量标准（Marker）电泳道，从上到下依次出现1353bp、1078bp、872bp、603bp、310bp、281bp、271bp、234bp、194bp、118bp、72bp共12条清晰的带。
阳性对照电泳道出现一条195bp清晰的带。空白对照电泳道不出现任何带。被检样品电泳道出现一条195bp的带，判为阳性（十）。被检样品电泳道没有出现大小为195bp的带，判为阴性（一）。3血清学试验
3.1间接血凝试验（Indirectheamagglution，IHA）3.1.1材料准备
3.1.1.1器材：96孔（8X12）V型（110）聚苯乙烯滴定板，5μL～50μL多通道微量可调移液器或稀释棒，微型振荡器，水浴箱等。3.1.1.20.15mol/LpH6.4PBS和含1%灭活健康兔血清的0.15mol/LpH7.2PBS稀释液（配制方法见附录G)。
3.1.1.3PG纯化灭活抗原（制备方法见附录C.1)。3.1.1.4抗原敏化红细胞（制备方法见附录H)。3.1.1.5对照血清（制备方法见附录C.4.1)：标准阳性血清的血凝效价为1：512～1：1024，标准阴性血清的血凝效价≤1：4。
3.1.1.6被检血清：应无溶血、无腐败，必要时可加入0.01%硫柳汞防腐。试验前灭活。3.1.2操作方法
3.1.2.1稀释被检血清：每份被检血清用8孔，从第1孔开始，至第8孔，每孔滴加稀释液25μL，用微量移液器或稀释棒吸（蘸）取被检血清25μL加人第1孔，充分混勾后吸（蘸）取25μL加人第2孔依次做倍比连续稀释至第8孔12、1：4、1：8.1：256），混匀后从第8孔弃去25μL。3.1.2.2加敏化红细胞（抗原）：从第1孔开始，至第8孔，每孔滴加1%敏化红细胞25μLNY/T1468—2007
3.1.2.3设对照：在每块V型滴定板上做试验，要同时设立对照，即敏化红细胞空白对照1孔，阳性血清（1：64）加敏化红细胞对照1孔，阴性血清加敏化红细胞对照1孔。3.1.2.4震荡：加敏化红细胞后将V型滴定板放在微型震荡器上震荡1min，置37℃温箱孵育2h，判定结果。操作程序见表1。
表1间接血凝试验程序及判定结果举例被检血清稀释度
稀释液
红细胞
微型震荡器上无荡1min，置37℃温箱2h++++
注：表中所示被检血清的血凝效价为1：1283.1.3结果判定
3.1.3.1凝集程度的判定标准：
“十十十十”红细胞全部凝集，形成一层均匀膜，布满整个孔底。“十十十”红细胞在孔底形成一层薄膜，面积比前者稍小。“十十”红细胞在孔底形成薄膜凝集，边缘松散或呈锯齿状。“十”红细胞在孔底呈稀薄、散在、少量凝集，孔底有小圆点。“士”红细胞沉于孔底，但周围不光滑或中心有空斑。“二”红细胞完全沉于孔底，呈光滑的圆点。1:256
单位：μL
各项对照
红细胞
3.1.3.2加敏化红细胞后所设各项对照均成立，否则应重做。正确对照的结果是：a）抗原敏化红细胞应无自凝（一）；b）阳性血清对照应100%凝集（十十十+）；阴性血清对照应无凝集（一）。3.1.3.3结果判定标准：
血凝效价≥1：16（十+）判为阳性：血凝效价<1：4（++）判为阴性；血凝效价介于两者之间判为可疑。3.2间接酶联免疫吸附试验（Indirectenzymelinkedimmunosorbentassay，I-ELISA）3.2.1材料准备
3.2.1.1PG3纯化灭活抗原（见附录C.1)、兔抗羊IgG辣根过氧化物（HRP）标记物（HRPIgG)，标准阴、阳性血清（见附录C)，被检血清。3.2.1.2试验溶液：配制方法见附录1。5
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3.2.2操作方法
3.2.2.1抗原包被：用抗原包被液（见附录L.1)，将PGs抗原稀释成一个单位（1.1μug/mL)，用微量移液器将稀释好的抗原加人到酶标板各孔内，每孔50uL，然后将酶标板置湿盒中于37℃吸附2h再转人4℃冰箱放置18h～20h。
3.2.2.2洗涤：甩掉酶标板孔内的抗原包被液，加人冲洗液（见附录1.2），室温下浸泡2min，甩掉冲洗液，用吸水纸吸干并驱除孔内气泡。再重新加人冲洗液，按同法洗涤4次。3.2.2.3封闭：每空加50μL封闭液（见附录.3），置湿盒中放37℃吸附1h。3.2.2.4取出酶标板，将其甩干，用冲洗液洗涤4次。洗涤方法同3.2.2.2。3.2.2.5加入被检血清：被检血清先用血清稀释液（见附录1.4）做1：60倍稀释，每份血清加两孔，每孔50μL。
3.2.2.6对照：每块酶标板均设标准阴、阳性血清和空白孔对照。标准阴、阳性血清做1：60倍稀释，每份血清加两孔，每孔50μL。空白对照加血清稀释液50μL。3.2.2.7加样完毕后，置湿盒中37℃温箱内孵育1h。3.2.2.8取出酶标板，将其甩干，用冲洗液洗涤4次。洗涤方法同3.2.2.2。3.2.2.9加HRP-IgG标记物：HRP-IgG标记物按标签上标记的效价稀释后使用，每孔加人50μL。置37℃温箱内孵育1h。
3.2.2.10取出酶标板，将其甩干，用冲洗液洗涤4次。洗涤方法同3.2.2.2。3.2.2.11加底物溶液：每孔加人新配制的底物溶液（见附录1.5）50μL，置37℃避光反应10min~15min
3.2.2.12终止反应：每孔加人终止液（见附录L.6）50μL。3.2.3判定
在酶标仪490nm波长处，测定酶标板的每孔光吸收值，求出每份被检血清2孔的平均光吸收值（S)，除以同板标准阴性血清2孔的平均光吸收值（N)，则得出每份被检血清的S/N值。判定标准：每份血清1：60倍稀释的S/N值≥3为阳性，S/N值≤2.5为阴性，S/N值介于2.53之间者为可疑。
A.120%马血清马丁肉汤
A.1.1成分
马丁肉汤
健康马血清
25%鲜酵母浸出液
25%葡萄糖溶液
1/80醋酸铊
青霉素
附录A
(资料性附录）
培养基制备
200IU/mL
NY/T1468-2007
A.1.2制法以上各种成分分别经灭菌或除菌后混合，在无菌条件下，用灭菌过的氢氧化钠溶液调整pH至7.8～8.0。将制备的马丁肉汤分装于灭菌试管内，每管5mL。置4℃冰箱保存备用。A.220%马血清马丁琼脂平板
A.2.1成分马丁肉汤（见附录A.1）中加人琼脂，使含量达1.3%～1.5%，即成马丁琼脂。A.2.2制法除健康马血清、1/80醋酸铊及青霉素外，其他成分经103.4kPa（121℃）高压灭菌30min。降温至55℃~60℃时，按上述比例添加马血清、1/80醋酸铊及青霉素后，在灭菌的直径6cm～8cm培养血内加人8mL，轻轻摇动混合均匀，静置凝固后即成马丁琼脂培养基。置4℃冰箱保存备用。
A.3葡萄糖酵解培养基
A.3.1葡萄糖酵解培养基（1)
a）基础培养基
心浸肉汤（经酶处理）
PPLO血清级份（Difco）
DNA（0.2%溶液，W/V)
0.06%酚红
1%醋酸铊
青霉素20000IU/mL
pH调至7.8
b）试验培养基
基础培养基
50%葡萄糖溶液（W/V）
pH调至 7.8
A.3.2葡萄糖酵解培养基（2)
在20%马血清马丁肉汤（见附录A.1）中加人10%葡萄糖。调pH至7.8，分装2mL/管。NY/T1468—2007
A.4精氨酸水解培养基
A.4.1精氨酸水解培养基（1)
a）基础培养基将葡萄糖酵解基础培养基的pH调至7.3即可。b）试验培养基向128mL基础培养基中加30%精氨酸溶液（W/V）4.25mL，调pH7.3即成。
A.4.2精氨酸水解培养基(2)
在20%马血清马丁肉汤（见附录A.1）中加人10%精氨酸。调pH至7.3，分装2mL/管。A.5磷酸酶培养基（BPh）
心浸肉汤琼脂（Difco)
马血清（60℃加热60min）
25%酵母浸出液
1%二磷酸酚酸钠盐
青霉素20000IU/mL
1%醋酸铊
pH调至7.8
A.6凝固血清消化培养基(Sd)
心浸肉汤（Difco）
马血清
25%酵母浸出液
无菌水
试验pH调至7.8，分装2mL/管，在流动蒸气中呈斜面放置，45min灭菌。冷却凝固成斜面。A.7菌膜、菌斑形成试验培养基
在20%马血清马丁琼脂（见附录A.2）中加人10%蛋黄乳剂。调pH至7.3。倾倒平血。B.1NET缓冲液（pH7.6）配方
Tris -HCl
(资料性附录）
PCR试验试剩的配方和制备
50mmol/L
125mmol/L
50mmol/L
B.2TAE电泳缓冲液（pH8.0）的配方和制簧50XTAE电泳缓冲储存液：
Tris碱
冰乙酸
加双蒸水至1000mL，应用前用双蒸水将50×TAE电泳缓冲液50倍稀释。31%的琼脂糖电泳凝胶板的配方和制备B.3
琼脂糖
1XTAE电泳缓冲液
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将琼脂糖放入TAE电泳缓冲液中，加热融化温度降至60℃左右时加人10mg/mL溴化乙锭（EB）3μL～5uL，均匀铺板，厚度为3mm~5mm。NY/T1468—2007
C.1PG纯化灭活抗原的制备
附录C
（规范性附录）
PG纯化灭活抗原和阳、阴性血清制备取PG：（≥10°CFU/mL）培养物2L，向菌液中加入10%甲醛溶液，使其终浓度为0.2%，随加随摇，使其充分混合，置37℃灭活12h（以瓶内温度达37℃开始计时），期间振摇3～4次，进行灭活。灭活检验合格的抗原，4℃8000r/min离心1h，沉淀物用0.15mol/LpH6.4PBS悬浮，如上洗涤3次后，配成20倍浓缩抗原，在冰浴条件下用低频率超声波间歇裂解30min，裂解物以1250r/min离心30min，以除去沉淀，收集上清液，即为PG纯化灭活抗原。C.2弗氏佐剂制备
C.2.1弗氏不完全佐剂液体石蜡油和羊毛脂按4：1（V/V）混合均匀，103.4kPa（121℃）高压灭菌30min，置4℃冰箱备用。使用时与抗原等量混合、乳化。C.2.2弗氏完全佐剂于弗氏不完全佐剂中加人无毒、灭活的分枝杆菌终浓度3mg/mL。使用时与抗原等量混合、乳化。
C.3阳性血清制备
选用体重2kg左右的健康雄性家免供免疫用。取充分乳化的弗氏完全佐剂抗原，于每只免两后腿足部皮下，帼淋巴结处及背部皮下多点接种，接种量为1.5mL，14d后仍以上述抗原和剂量由背部皮下多点接种，进行第二次免疫；隔11d后，以弗氏不完全佐剂抗原，由每只兔肩部肌肉2点背部皮下多点接种，接种剂量为3mL，为其第三次免疫；11d后，取制备好的不含佐剂抗原（10mg/nL）由每只免耳静脉注射1.5mL，进行第四次高免，隔14d后采血分离血清。C.4阴性血清制备
C.4.1选取经血清学证实为山羊接触传染性胸膜肺炎抗体阴性的健康山羊，用常规方法采血，无菌分离血清。
C.4.2选取健康雄性家免，用常规方法采血，无菌分离血清。10
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