【农业行业标准(NY)】 牛毛滴虫病诊断技术

ICS11.220
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 1471—2007
牛毛滴虫病诊断技术
Diagnostic techniques for bovine Trichomoniasis2007-12-18发布
2008-03-01实施
中华人民共和国农业部发布
本标准的附录A为资料性附录。
本标准由农业部市场与经济信息司（农业部质量办公室）提出。本标准由农业部畜牧兽医局质量标准办公室归口。本标准起草单位：南京农业大学动物医学院。本标准主要起草人：李祥瑞、徐立新、李春华、汪志楷、郑增忍。NY/T14712007
NY/T1471—2007
毛滴虫病是由胎儿三毛滴虫（Tritrichomonas foetus）寄生于牛生殖道引起的疾病。该病呈世界性分布，引起牛，尤其是奶牛生殖器官炎症、死胎、流产和不育，对畜牧业生产造成严重的经济损失。毛滴虫病被世界动物卫生组织列为B类疾病。该病主要通过自然交配传播，以染病动物的精液和污染的器械人工授精也可引起传播。1范围
本标准适用于毛滴虫病的诊断。牛毛滴虫病诊断技术
NY/T 1471—2007
本标准规定了毛滴虫病的病原鉴定、聚合酶链反应(PCR)扩增虫体DNA的检测方法和结果判定标准。
2原理
2.1胎儿三毛滴虫可在显微镜下直接观察，也可经姬姆萨染色法染色后观察。2.2以胎儿三毛滴虫虫体DNA作模板，应用特异性的引物进行PCR反应，能扩增出特异性的条带。主要材料和试剂
3.1显微镜
3.2载玻片
3.3染色血
3.4姬姆萨(Giemsa）染色液
3.5姬姆萨染色液稀释液
3.6PCR仪
离心机
PBS(pH7.20.01mol/L)
3.9CTAB抽提液
0CTAB/NaCI溶液
高速离心机
涡旋振荡器
3.13PCR引物
引物TFR3(5'-CGGGTCTTCCTATATGAGACAGAACC-3')引物TFR4（5-CCTGCCGTTGGATCAGTTTCGTTAA-3）3.14热启动Tag聚合酶
51XPCR反应缓冲液
3.16400μMdNTPs
3.171.5mMMgClz
3电泳仪
粉碎器，匀浆器，研钵和研杆，捣碎机3.20
抗有机溶剂的试管或烧杯
检测步骤
4.1临床观察
根据临床病史，母牛早期流产、多次复配不孕或发情不规则、阴道分泌物增加、子宫蓄脓，公牛包皮NY/T1471—2007www.bzxz.net
黏膜有结节、分泌大量脓性物和不愿交配等病史或症状和体征可做出初步诊断。4.2采样
4.2.1母牛首先将母牛外生殖器洗涤干净，然后用40mL以上的注射器，将30mL～40mL的30℃～35℃灭菌生理盐水急速注人阴道，以洗涤子宫和阴道壁，然后将洗涤液收集于离心管中，以1500r/min～2000r/min离心沉淀5min后，取沉淀物作为待检样品。也可取一长30cm，直径0.9cm，并在离一端9cm处弯成150度角的消毒玻璃管，注人少量的30～35℃灭菌生理盐水，收集母牛子宫颈黏液作为待检样品。收集待检样的适宜时间为发情过后几天。4.2.2公牛首先将公牛外生殖器洗涤干净，吸取5～10mL的30～35℃灭菌生理盐水注入包皮腔内，然后以手压紧包皮口，使液体在腔内滞留3～5min后，再将洗涤液收集于离心管中，以1500r/min~2000r/min离心沉淀5min后，取沉淀物作为样品。4.2.3精液取自人工采集或融化的冷冻精液适量，作为待检样品。4.2.4产仔牛、流产牛等可取胎盘液；流产胎牛可取胎儿第4胃的内容物；病牛可取子宫积脓排出物，以1500r/min～2000r/min离心沉淀5min后，取沉淀物作为待检样品。4.2.5样品采集后应立即镜检，若用于PCR检测可低温冷冻保存。注：不同情况下毛滴虫的数量有所不同，在流产胎儿、流产后几天和新近感染母牛子宫里均含有大量虫体。在感染后12～20天的母牛阴道黏液内也含有大量虫体，在一个发情周期内毛滴虫的数量也有所不同，发情后3～7天内毛滴虫的数量最多。这些时段采集的样品可直接进行镜检。4.3虫体显微镜检查
4.3.1压滴标本检查法
将采集的待检样品1滴置于载玻片上，盖上盖玻片，在100倍或以上倍率的显微镜下，视野放暗，迅速进行检查。可重复进行2～3片。4.3.2染色标本检查法
将采集的待检样品少量置于载玻片一端，立即推制成均勾的薄膜，在室温下干燥，后用甲醇固定2min，将固定的抹片浸人足量的姬姆萨染色稀释液的染色皿中，染色0.5～1小时，取出水洗，吸干或烘干，镜检。
4.4PCR扩增虫体DNA检查法
4.4.1虫体DNA的制备
将采集的样品与PBS混合至总体积5.0mL，在涡旋振荡器上混匀，取出1mL移入1.5mL微量离心管中，10000r/min离心5min，弃上清，在沉淀物中加人2mLTE（10mmol/L），转人另一5mL离心管，再加人100μL的10%SDS和50μL的5mg/mL的蛋白酶K，再加10μL的RNA酶，混匀，于37℃温育1h～2h；加人300μL的5mol/LNaCl充分混匀；再加人240uLCTAB/NaCl溶液，混匀；于65℃温育15min；加人等体积的/氯仿，混匀，10000r/min离心4min～5min；上清转人新管中，加人等体积的酚/氯仿混匀，10000r/min离心5min；上清转人另一新管中，加人0.6体积异丙醇，轻摇混匀，15000r/min4℃离心10min~15min，弃上清；沉淀DNA用70%乙醇10000r/min离心洗涤，弃上清，重复洗涤一次；干燥。用尽可能少的TE缓冲液重悬，立即使用或一20℃冰箱冻存备用。也可将采集的待检样品用DNA提取试剂盒进行虫体DNA的制备。4.4.2PCR扩增
采用50uL标准反应体系：引物TFR3（5，-CGGGTCTTCCTATATGAGACAGAACC-3）和TFR4(5-CCTGCCGTTGGATCAGTTTCGTTAA-3）各1.0μM1XPCR反应缓冲液；400MdNTPs；1.5mMMgCl2；2U热启动Taq聚合酶；5μl待检样品DNA溶液，用双蒸水补足体积至50μl。首先在95℃预热10min以活化热启动Ta聚合酶，扩增条件为94℃变性30s，67℃退火30s，72℃延伸90s，35个循环，然后72℃延伸15min。1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。2
5结果判定
5.1在显微镜下观察到胎儿三毛滴虫即可判为阳性。NY/T1471—2007
胎儿三毛滴虫呈纺锤形、梨形。体长8um~18um、宽4μm～9um，呈活泼的蛇形运动。虫体的鞭毛及波动膜运动时，才可察知其存在。活动的虫体不易看出鞭毛，运动减弱时可见鞭毛。在姬姆萨染色液染色后的涂片中，虫体前半部有核，有一个不易观察到的胞质体和副基体。有鞭毛4根，3根向前游离，与体长相等；1根向后沿波动膜向虫体后端延伸，并延伸出虫体后部成游离鞭毛。波动膜有3个～6个弯曲。虫体中央有一条纵走的轴柱，起始于虫体前端，沿体中线向后延伸，其末端突出于体后端。虫体前端与波动膜相对的一侧有半月状胞口。5.2PCR扩增虫体DNA时，若样品能扩增出347bp的特异性条带，可判定为阳性。5.3若显微镜检查为阴性，则选择PCR扩增虫体DNA进一步检查，仍为阴性时，结果判为阴性。6结果报告
根据结果判定，做出报告。
NY/T1471—2007
A.1姬姆萨染色液
姬姆萨染料
甘油(中性)
A.2姬姆萨染色液稀释液
附录A
(资料性附录）
标准中涉及的试剂配制方法
姬姆萨染色液1份加人19份新煮过的中性蒸馏水或pH7.2的PBS中配成。A.3PBS(pH7.20.01mol/L)
NazHPO41.1g或NazHPO,·12H,O4.77gNaH2PO4·H20.3g或NaH2PO·2H2O0.34g加蒸馏水至1000mL
A.4CTAB抽提液
2%(w/v)CTAB(十六烷基三乙基溴化铵）100mmol/LTris·Cl.pH8.0
20mmol/LEDTA,pH8.0
1.4mol/LNaCl
于室温保存（可在几年内保持稳定）。A.5CTAB/NaCI溶液(10%CTAB/0.7mol/LNaCI)在80mL水中溶解4.1gNaCl,缓慢加入10gCTAB（十六烷基三乙基溴化铵）同时加热并搅拌。如果需要，可加热至65℃溶解。定容终体积至100mL。
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。