【农业行业标准(NY)】 香蕉 组培苗

ICS 65.020.20
中华人民共和国农业行业标准
NY/T357—2007
代替NY/T357—1999
组培苗
Banana in vitro plantlet
2007-12-18发布
2008-03-01实施
中华人民共和国农业部
本标准是VY/T3571999《香蕉组培苗》的修订版。本标雅代替NY/T357-1999&香蒸红培苗》。本标准与 NY/T 357—1999 相比主要差异如 卜喇除、修改和增加了部分术语和定义；—删除了“4.2组培条件\和\4.3假植条件”；修改了香蕉病毒检测程序；
一增加了组培瓶苗的抽样方法；增加了品种纯度和变异率的计算公式：-增加了判定规则和复验规则：
NY/T 357- 2007
增如了资料性附录“聚台酶链式反应(FCR)技术检测香蕉束项病和花叶心腐病病声程序”（见附录A；
修改了1999年版的附录A“弃黛组培瓶曲质量检测记录表”，附录B\香蕉袋装苗质量检测记录表”和附录心“香蕉组培苗质量检验证书”.并将其分别作为本版的附录B“香黛组培瓶节检测记录表”附录“香蕉装装黄检测记录表”和附录力“香黛组培苗检验证书”：Ⅲ除1999年版的附录D“香蕉种苗标签”：
调整了标准的结构，
本标准的附录A,附录B、附录C和附录均为资料性附录。本标准出中华人民共和国农业部表垦局提出.本标准由表业部热带作物及制品标准化技术委员会归口。本标起草单位：中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所、华南热带农业大学园艺学院。本标主要起草人李志英、李绍鹏、徐立、马千全、李茂富、蔡胜忠、郑玉，李克烈。本标准于1999年首次发布，本次为第一次修订。I
1范围
香蕉组培苗
NY/T357—2007
本标雅规定了香燕(MusananaLour.）组培苗的术语和定义、要求、试验方法、检验规则、包装、标志、运输和贮存。
本标罹适用于香蕉组培苗。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款，凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用丁本标准，然而，鼓励据本标准达成协议的各方究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用丁本标准。GB6000--1999主要造林树种苗木质量分级GB15569农业植物调运检疫规程
中华人民共和国国务院令1992年第98号植物检疫条例中华人民共和国农业部令1995年第5号植物检疫条例实施细则（农业部分）3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。3.1
外植体explant
用接种培养的各种离体的植物材料，包括胚胎脂材料、各种器管、组织，细胞，皮原生质体等。3.2
香蕉组培瓶苗 banana in vitro plantlet eultured in vessel利用优良香蕉品种的吸芽茎尖作为外植体，采用植物组织培养技术在培养容器1生长且已达到假植标谁的根、茎、叫俱全的完整无菌香蕉小植株，3.3
香蕉袋装苗bananaplantletplantedinculturebag香蕉瓶苗分级假植丁装有营养十的特定规格塑料袋中可出圃供大田定植的香燕苗，3.4
假植tempararyplant
从香蕉瓶苗移于荫棚(苗圃)至装苗山画之前的个育古过程。3.5
继代培养subculture
在外植体初次培养的基础上，把所获得的培养物转移到新鲜的培养基叶进行再培养，从而使培养物得以成倍增殖的过程，义称增殖培养。3.6
品种纯度purilyof wariety此内容来自标准下载网
指定品种的种苗株数占供检种苗株数的百分率，3.7
NY/T357—2007
变异 variation
在组织培养过程中受培养基和培养条件等影响，培养出的香蕉株的遗传特性发生牛了明显变化,其形态上也显著表现出有别于原品种植株的特征江：否组培苗恋另主要特征为;叶变细长，叫面不规则凹凸，叫片扭曲，部分缺呈花叶状；叶抛变长;叶鞘散牛呈散把；植株变矮；果实变短小，果实尾端过度仲长等，4要求
4.1外植体采集与处理
4.1.1来芽母本园
品种纯正无香蕉花叶心腐病和束顶病病株的香蕉园。4.1.2采芽母株
在4.1. 1中选择农艺性状优良的植株作为采芽母株，逐株编号并按5. 1进行病毒检测。4.1.3无菌外植体
从采芽母株采集生长健壮的吸芽，无菌条件下取其生长点作为外植体。增殖一状后按5.1进行病检测，经验证无病毒的株号其增殖芽方能继续增殖(继代)培养，有病的株号其增殖芽应全部焚烧销毁。
4.2基本要求
4.2.1瓶苗
种源来白品种纯正，优质高产的母本园或母株品种纯度298%：
无污染；
继代培养不超过15代，时间不超过12个月：-根系白,粗,且有分权、侧根及根毛；生长正常，假茎色黄绿，基部不成钩状，叶鞘不散开，变异率2%，
4.2.2袋装苗
种源米自品种纯止的瓶苗；
品种纯度?98%；
叶色青绿不徒长，叶片无病斑或无病虫为害！根系生长良好；
无机械性损伤；
变异率率5%。
4.3分级
在符合基本要求的前提下，产品分为一级和二级。香蕉瓶苗的等级应符合表1的规定，香蕉袋装苗的等级应符合表2的规定。
香蕉瓶苗分级指标
假茎粗，rm
假茎高.cm
展开叶片数，片
白色根，条
0. 2 ~ 0. 3
3. 0-~ 3. 9
叶片数，片
假茎粗+cn
叶片宽,cm
5试验方法
5. 1病毒捡测
表2香蕉袋装苗分级指标
28或~5
0. 7~-0. 9
5. 2 ~~6. 7
NY/T 357—2007
用聚合酶链式反应（PCR)技术对采芽母袜和无菌外植体进行病毒检测（见附录A）5.2外观检测
5.2.1瓶苗
5.2.1.1用目测法检测污染情况、植株根系和假的生长情况。5.2.1.2假萃粗：用游标卡尺测量假茎基部以上2cm处的直径。5.2.1.3假茎高：用钢卷尺测量从假茎基部至最新自然展开叶的叶柄与假茎交会处的高度，5.2.1.4叶片数：用钢卷尺测量叶面宽度，记录最宽处≥0.8cm的自然展开叶的叶片数。5.2.1.5白色根：用钢卷尽测量白色根长度，记录≥3cm长的白色根条数5.2.2袋装苗
5.2.2.1用目测法检测植株的生长情况、叶片颜色、病虫害和机械损伤。5.2.2.2叶片数：记录瓶苗移裁后假植期间新长出的完整展开绿叶数。5. 2.2. 3假类粗:用游标卡尺测量袋面以,上 2 cm 处的直径。5.2.2.4假茎高用钢卷尺测量从袋面至最新展开叶的叶柄与假茎交会处的高度。5.2.2.5叶片宽：用钢卷尺测量最新展开叶中部最宽处。5.2.3数据记录
测量数据分别记人附录 B和附录 C的表格中5.3品种纯度检测
采用目测法观察组培苗的形态特征，或采用其他有效方法，确定检验样品组培萨中指定品种的组培苗株数。品种纯度按公式(1I)计算：P=
我中·
P品种纯度，单位为百分率（%)；所一样品中指定品种数，单位为株；N—所检样品,总数,单位为株
计算结果精确到小数点后：位。将检测结果记人附录)的表格中。5.4变异率检测
观察所检样品的形态特征，或采用其他有效方法，确定变异株数。变异率按公式（2）计算：x100
NY/T3572007
Y—变异率,单位为百分率(%);
2样品中变异株数，单位为株；
Nz一所检样品总数单位为。
计算结果精确到小数点后一位。将检测结果记人附录D的表格中。5.5疫情检测
按CB15569、中华人民共和国国务院令1992年第98号和中华人民共和国农业部令1995年第5号的有关规定进行。
6检验规则
6.1组批
同一品种、同一批销售、调运的产品为一检验批。6.2抽样
6.2.1组培瓶苗
采用随机抽样法抽样。批最样品少于10瓶时，全部抽样：11～100瓶时，抽10瓶；超过100瓶时，按下列公式抽样：
T -MX10%-
T,=Ti 1 (M-1000)X2%
T,=T +[(M 1000)×2%7+_(M-10000)×0.2%}-.式中：
T，—101~～1000瓶时的抽样数
T-1001~10 000 瓶时的抽样数;
T：——10000瓶以上抽样数；
批量样品总数。
计算结果保留整数。
6.2.2组培袋装苗
按GB600019994.1.1的规定执行
6.3交收检验
：(4)
每批种苗交收前，生产单位应进行交收检验。组培瓶苗的捡验在出厂时进行，袋装苗的检验在出面时进行。交收检验内容包括外观、包装和标识等。检验合格并附检验证书(见附录D)和检疫部门颁发的检疫合格证书方可交收，
6.4判定规则
同一批检验的-级组培苗中，允许有5%的苗低下一级苗指标,但应达到二级苗指标,超过此范围，则为二级苗：同一批检验的二级苗中，允许有5%的苗低于二级苗指标，但应达到4.2的要求，超过此范围则该批苗为不合格。
6.5复验
当贸易双方对检验结果有异议时，应重新抽样复验一次，以复验结果为最终结果：7包装、标志、运输和购存
7.1包装
如需调运，瓶苗仍保留在组培器中，并用水箱或纸箱进行包装；袋装苗应用木箱、塑料箱等硬质包装箱包装，
7.2标志
NY/T 357—2007
组培苗应附有标签。标签内容包括类型（瓶苗或袋装苗）、品种、检验证书编号、等级、数量（株数）、育苗单位、出厂（圃)日期。标签用150g的牛皮纸制成，标签孔用金属包边。7.3运输
按不同品种，级别装车。组培苗用篷车运输，并保持通风透气；运输途中避免日晒、雨淋；装车时应小心轻放。
7.4贮存
出厂（面)后应在当日装运，到达目的地后要立即卸车，并置于荫棚或阴凉处，瓶苗应及早进行假植，袋装苗应及早进行定植，若有特殊情况无法及时假植或定植时，贮存时间不应超过7。烂存时置于荫棚中，保持通风，袋装苗应注意喷水保持土柱润。NY/T 357- 2007
附录A
(资料性附录）
聚合酶链式反应(PCR)技术检测香蕉束顶病和花叶心腐病病毒程序A.1待测样品的采集
A.1.1采芽母体
在采芽母本园取各编卡母株的幼川1～2名作为待测样品。材料取回后洗疗擦下，装在密封保湿塑料袋中，送到检测单位进行检测。若不能马上送到检测单位并进行检测，须将材料放置于一20冰箱中保存。
A1.2无菌外植体
从无菌外植体第一代增殖芽小取一个增殖芽,称取1乌～2g作为待测样品。其他处理同A.1.1。A. 2香蕉束项病的 PCR 检测
A.2.1DNA模板的制备
称取待测材料 0.2 g：加液氮研磨成粉末状，加.入0.8m.的抽提缓液(2%CTAB.100 mmol/LTris-IICl,2C l/L FDTA,1.1 mul/L NaCl,2%统基乙醇,I%PVP)混合使之充分湿润,于 65C温育30min~~60min，不断混勾；加人等体权的氯仿/异戊醇，颠倒使之充分混合，」4下750Cg离心15 Ilin,国收J-相;加人1/10体积的 65℃预热的10XCTAB(10%CATB,0.7mol/LNaCI)落液，颠倒混勾,再加人2倍体积的无水乙醇，颠倒混勾，1%下7500g离心151im,弃清液，分别用70%及95%乙醇洗涤汇淀各一饮;吹T,加人50 μLIE(10 mInol/L Tris-HCl,1 mmol/L EDTA)溶解沉淀;取2μL在1.0%的琼脂糖凝胶_上电泳，紫外灯下观察DNA纯度并估算其浓度,其余置于一20亡冰箱中备用。A.2.2PCR特异引物的设计
用于检测香焦束顶病病毒的特异性引物对碱基序列为：引物1(:)5-ATCAAGAAGACCCGG GTT -3'.5引物2(P:)5'-TCA AAC AIG ATA TGT AAT TC-3',其扩增片段大小为490 bp.A.2.3待测样品的PCK扩增反应
PCR扩增反应体系的总体积为25μl..包括10×PCR反应缓神液2.5μl,2mal/IdVTPs2μLDVA模板 1. 0μL,,P. 和 P.各 2μl.,双火菌水 15μl. 最后人 Taq DNA 案台酶(0. 5 U/μl.)0. 5 μl.,各反应物混勾后,在PCR扩增仪上进行扩增反应。反应程序为：(1)94℃ 4min；（2)94℃1 min,58℃1min,72℃1min,共30个循环；（3)72℃10min，每次扩增反应均设清水空白对照、健康植株样品负对照及含香蕉束病病原DNA的止对照个,每个试验均进行2次～3次重复A.3香蕉花叶心腐病的PCR检测
A.3.1DNA模板的制备
RVA的提取：称取待测材料(.2：加液氨研磨成粉末状，加人(.8ml.的抽提缓冲液(2%CTAB,100 mmol/L Tris-HCl,20 mimol/1. ETA,1. 4 mol/L NaCl,高压灭菌后加人2%蔬基乙醇,1% PVP)混合使之充分鼎演，于65C温育30min-~60mim：不断混匀：加人等体识的氯仿/异成醇，颠倒使之充分据合，于1%7500g离心15min，回收上相；加人0.6倍体积的8mol/.的I.il溶液，4℃冰箱中过夜，4%下1200Cg离心30min；弃上清液，分别用70%乙停洗涤沉淀两次：4℃下8000g离心1min弃上清6
NY/T357—2007
液，将沉淀吹干，用50LJ>EPC处理过的无菌双蒸水溶解沉淀，取2μL在1.0%的琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下观察RNA的完整性和纯度。根据反转录试剂盒使用说明，将提取的RNA反转录合成cDNA，置于20℃冰箱中备用。
A.3.2PCR特异引物的设计
用于检测香蕉花叶心腐病病毒的特异性引物对减基序列为:引物 3(P,)5°-CAC CCA ACC TTITG GGT AG-3',引物 4(P)5-CAA CAC TGC CAA IC AG: TC-3,其护增片段人小为557bpe
A.3.3待测样品的PCR扩增反应
PCR扩增反应体系的总体积为25μL，包括10×PCR反应缓冲液2.5mL2mol/.dVTPs2μL，cDNA模板1.0,P，和P各2，双蒸灭菌水15μl,最后加TaQDNA聚合酶(0.5U/L)0.5μL.各反应物混勾后，在PCR扩增仪上进行扩增反应：反应程序同A,2.3。每次扩增反应均设清水空白对照健康植株样品负对照及含香蕉花叶心魔病病原cTNA的正对照一个，每个试验均逃行2次～3重妄
A,4待测样品的检测结果判断
PCR扩增反应完毕后,取5iL扩增产物用1.0%的琼脂凝胶电泳30min～40min。电泳完毕后，在254nm的紫外灯下观察，在含香蕉束顶病病原DVA或香蕉花叶心腐病病原cDNA的正对照样品中，能观察到相应长度的特异性片段，而清水空白对照、健康植抹样品负对照的样品中则扩增不到这些特异性的电冰条带，如果在待检测的样品中能扩增出相应长度的特异性电泳条带，则证明该检测样品带有香蕉束顶病或花叶心腐病病毒。反之，如果在待检测的样品中不能扩增出相应长度的特异性电泳条情，则证明该检测样品不带香蕉束顶病或花叶心腐病病毒。注：提取RNA时，所有试剂均用0.1%的DEPC处理过的双蒸水配制并高压灭菌；所用塑料耗材须经J.1%的DEFC:水处理 24 h以1:并商压火菌,所用研锌、药匙等须经180℃高温灭菌2 h以上，NY/T 357
附录B
(资料性附录】
香蕉组培瓶苗检测记录
香蕉组培瓶苗检测记录表
香蕉组培瓶苗验测记录如表B1所示。品
育苗单位；
出圃株数：
样株号
审核人（签宁）：
假举粗
假茎高
校梭人（整字）：
凝三叶数
白色根
（条）
检测人（签)：
购苗单位：
抽检数：
韧评级别
不合格
检测日期：年月日
附录C
【资料性附录
香蕉袋装苗检测记录
香蕉袋装苗检测记录如表C.1所示。种
育苗单位：
出圃株激，
样株号
审梭人（签字)：
叶片数
（片）
校梭人（签字）
橄基粗
香蕉袋装苗检测记录表
叶片宽
检测人（签）
购苗单位：
抽检棘数：
初评级别
VY/T357—2007
不合格
格測口期：
NY/T357-2007
香黛组培苗检验证书如表L,1所示附录D
【资料性附录】
香蕉组培苗检验证书
表D.1香蕉组培苗检验证书
育苗单位
购买单位
总样数
分级检验
样品叶1各级别种苗株数
样品中各级别种苗样数占抽
检种苗株数的比例.5
检验结果
品种纯度，%
有无检验检疫证明
检骏结论
检验单位(章）
证书有效期
种苗类型
抽样数
A：一级
变异率,%
检验人（笠字）
编号：
A：培瓶苗
B:组培袋装苗
不合格
不合格
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。