【商检行业标准(SN)】 副结核分析枝杆菌PCR检测技术操作规程

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1907---2007
副结核分枝杆菌PCR检测技术
操作规程
Prolocol of the PCR for m ycobacterium paratubercuiosis2007-05-23发布
中华人民共和国
麻腐路药
国家质量监督检验检疫总局bZxz.net
2007-12-01实施
中华人民共和国出人境检验检
行业标推
副结核分技杆菌 PCR检测技术
操作规程
SN/T 1907—2007
中国标准出版出版
北京复兴门外三里河北街16号
邮政编码：100045
网址 www, spc. net. cn
电话：6852394668517548
中国标准出版计望岛印别厂印刷开本880×12301/15印张0.5字数7千字2007年9月第-～版2007年0月第一次印别印数1 2 000
书号：155066·2-18051定价 6.00 元YYKAONIKACa
本标难的附录 A和附录B均为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位中华人民北和国山西出人境检验检疫局SN/T 1907--2007
本标雅主要起草人：巩红酸、磨慧锋、连庚宽、巩强、吴海军、萄雨平、李卫华、张相维。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。1范围
副结核分枝杆菌PCR检测技术
操作规程
本标准规定了副结梭分枝杆菌PCR检测方法。本标准适用于牛、羊等反各动物的楚便及奶中副结核分枝杆菌的检测。2规范性引用文件
YYKAOKAca
SN/T1907—2007
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单不包括勘识的内容）或修订版均不适用于本标谁，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（cqVISO3696：1987）3试剂和材料
3.1主要仪器
3.1.1PCR热循环仅。
3.1.2大平。
超净下作台。
消毒灭菌锅。
商速冷冻离心机。
低温冰箱，冷葱玲冻冰箱。
实验用水制备装置。
高温干燥箱。
旋涡掠荡器。
凝胶成像分析系统。
恒温水浴振荡器。
磁力搅拌器。
微基移液器。
3.2主要试剂
3.2.1除另有现定外，所有试剂均采用分析纯或生化试剂。3.2.2实验用水：应符合GI/T6682中一级水的规格。所用试剂配方参见附录A。4检测步骤
4.1样品的制备
4.1.1标准菌株：副结核分枝打菌用国家质检总局指定单位提供。4.1.2粪便：称取新鲜粪使1，加3mlFBSpH7.4参见第A.5章），混匀.放置0min或3001/min室溢离心5min，取.上清液，温放置30min或3001/min究温再次离心5min.取上落液，12000r/min空温离心15min，弃上清液，加人400ul，TE。4.1.3奶样：无菌操作取1mL奶加10μlTri10n×-100，混句，12000r/min室温离心15min弃上清2
SN/T 1907—2007
液，管壁残留的奶样用灭菌的棉签擦掉，加人400μLTE4.2DNA模板的提取
4.2. 180C水浴加热20 min,冷至究温。4.2.2加50zL溶菌（参见第A.2章）37℃气浴振荡培养1h。4.2.3加75μLSDS/蛋白酶K（参见第A.3章).泥匀.65℃水浴加热10min。4.2.4加100μL5mal/I.NacI和100μl.65C预热5min的CTAB/NaCl(参见第A.4弃），上下颠例混匀，直至液体变为自色（奶状），65水浴加热10mi4.2.5加750ul.三绒甲烷：开成醇（24：1)，混勺12000r/min室温离心5min。4.2.6取上层水相于新管，加等体积的三氯币烷：异戊醇（24：1).混匀，12000r/min室温离心5min。4.2.7取土层水相于新管，小心加人0.6体积的异丙醇流淀核酸.小心手摇混勺，一20℃放置30min12 000 r/min 案温离心15 min.4.2.8弃上清液，加人500uL预冷的70%的醇12.000/min室温离中5min，弃上清液。4.2.9小心吸走波体，案温下十爆10左右，用50iLTE（参见第A.章）溶解，4℃保存。4. 3PCR 法
4.3.1引物：来源于美国表业部：正向引物：Primcr90：5*-GITCGGGGCCGTCGCTAGCF-3
反尚可物,Primer9,5*-GAGGTCGATCGCACGTGA-3扩增副结核分枝杆菌茶因中的100hpDNA书，环条件：93℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸3 min,共33个循环。
4.3.2PCR反应体系见表1.检测过程中婴设这阳性对照，阴性对照和牢白对照，用副结核标准菌株的模板DNA作阳性对照,用其他非副结数菌的模板DNA假阴性对照，用水军空白对照模板。表_LICR应应体系
试剂名称
l0×PCR Bulfer(不含 Mg*）
氧化镜（MgCl2）
dNTP Mixtute
模板IAA
备波浓度
500 mmol/Fkcl .l00 m:igtit Tris Cl(pHS.3
盗退下）
25mmll/L
cCTP,GTP,dTTP(各 3+2 Jmol)
100phnl/ul
5 U/ml
证：反应体系中各试剂的赴根据反应体系的总体积进行适当调整。4.3.3PCR扩增产物电泳检测
加人反应体系的体积/μL
补足至反应总体积为 25 μL
取1.5g琼脂糖，加入100mL电泳缓冲液（参见第A.6紊）加热溶解，加人浪化乙锭至终浓度为1pg/ml，制胶，将5ul.～8uL的Marker和PCR扩增产物分别与适量的如样缓冲液混合.点样。9 V/etn 恒压,电冰 40 min左右,凝胶战像分析系统检测并记录结果。5结果判定及表述
PCR后，阳性对照会出现一条400 的DNA片段，阴性对照和空白对照设有该核带，待检样品巾如出现100bp的DNA片段为检测结果阳性，即检出制结核分极杆菌。如木出现400bp的DNA片段为检测结果阴性，即末检出副结核分枝杆荫。2
(资料性附录）
试剂配方
YTKAONKAca
SN/T 1907-—2007
A. 1 TE 缓冲液:10 mL 1 mol/L Tris(pH 8. 0),2 mL 0. 5 mol/L Na.EI)IA(μH8, 0),加水定容至1000 m，分装后商压灭菌备用。A.2菌酶：用10ntul/LTris(pH8.0)配置成10 nig/mL.浓度，分装后一20℃保存。A.3SDS/蛋自酶K：在70mL10%SDS中加人5mL10mg/mL蛋白K箍匀即成，称取10gSDS加人到90mL水中，加热到68℃，磁力搅排器助落，滴加浓盐酸调1到7.2，水定窄至100mL：用灭菌的50mrol/LTrisA4CTAB/NaCI：称取4.1氛化钠（NaiCI)溶于80mE.水中，缓慢加人10gCTAB，同时搅举，完全溶辩后，加水至10om
A. 5 PBS(pH7. 4):溶液 A:0. 2 mol/L 磷段二氢钠(NaII,PO,)(27. 8 g 溶于 100 mL 水);溶液 B:0.2mo1/L磷酸氢二钠（NaHPO)(53.65NHPO.7H.O或71.7gNazIIFO,·12HO溶于100mL水)，取溶液A19.0mL和溶液B81.0ml.混合后加人适量水至终体积为200mL。A.6电泳缓冲液（TBE)Tris54g.硼酸27.5g,0.5mul/I.EnTA(pH8.0)20ml加蒸水至1000L；使用10倍稀释。
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附录B
（资料性附录）
扩增产物的参考序列
GTTCGGGGCCGTCGCTTAGGCTTCGAATTGCCCAGGGACGTGGGTATGGCTTTCATGTGGTTGCTGTGTTGGATGGCCAAGGAGATTGGCCGCCCGCGGTCCCGCGACGACTCGACOGCTAATTGAGAGATGCGATTGGATCGCTGTGTAAGGACACGTCGGCGTGGTCGTCTGCIGGGTTGATCTGGACAATGACGGTTACGGAGGTGGTTGTGGCACAACCTGTCTGGGCGGGCGTGGACGCCGGTAAGGCCGACCATTACIGCATGGTTATTAACGACGACGCGCAGCXATTGCTCTCGCAGCGGGTGGCCAACGACGAGGCCGCGCTGCTGGAGTTGATTGCGGCGGTGACGACGTTGGCCGATGGAGGCGAGGTCACGTGGGCGATCGACCTC
书号：1550652-18051
SN/T 1907-2007
定价：
6. 00 ,元
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