【国家标准(GB)】 饲料中黄曲霉毒素B1的测定 酶联免疫吸附法

ICS 65. 120
中华人民共和国国家标准
GB/T17480—2008
代警GB/T17480—1998
饲料中黄曲霉毒素B，的测定
酶联免疫吸附法
Delermination of aflatoxin B, in animal feeding stuffs-Enzyme-linkedimmunosorbentassay2008-11-21发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局数码防伪，
中国国家标准化管理委员会
2009-02-01实施Www.bzxZ.net
GB/T 174802008
本标摊代G13/T174801998《料中黄也毒素B,的测定酶联免疫吸附法》。本标准与（B/T174801998相比主要修改如下：范围中增加\本标准检出限为0.1 g/kg”规范性引用文件中，用“C13/T20195动物饲料试样的制备”代替\GB/T838」1987饲料中黄曲毒案B，的测定方法”；
试剂盒组成中，增加“注意：不同测试盒制造商间的产品组成和操作会有细微的差别·应严格按说明书要求规范藥作”；
仪器、设备条款中,删除冰箱条款:增加电动振荡器、具塞磨三角瓶：.-·-将\取样\条款改为“试样制备”，同时将“按GB/T8381-1987中5.1要求采集，处理样品，制成分析用的试样”改为~按G13/T20195要求制备试样\一限量测定条款中，将测定操作的分级条款合并为·个条款，并删除表格，均用文字叙述测定过；
定量测定条款中增加*结果保留2位有效数字”；原“具他条款册除，将“凡接触AF13：的容器，带浸人1%次氯酸钠N：CO,率液，12h后清洗备店，为分析人员安全，操作时要带医用乳胶于套\改为“些告”条款；增加了资料性附录A：
将样品溶液稀释表及稀释倍数与结果计算表作为资料性附旋3。本标雄的射录A利附录B均为资料性附录。本标雅的全国饲料工业标准化技术委员会提出并烂口，本标雅起草单位：江苏省徽生物研究所有限责任公司，本标准主要起草人：李利东、密晓黎、袁兴、杜妹莲。本标准于1998年首次发布，本次为第一次修订。1
1范围
饲料中黄曲霉毒素B，的测定
酶联免疫吸附法
本标准规定了饲料中黄曲震毒素B，的酶联免疫吸附测定（ELISA）方法。本标准适用于各种饲料原料、配合饲料及浓缩饲料中黄曲霉毒素B，的测定。本标准检出限为0.1g/kg。
2规范性引用文件
GB/T 17480—2008
下列文件中的条款追过本标准的引同而成为本标雅的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不迈用于本标谁，然而鼓谢根错本标推达故协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版木。凡是不日期的引用文件，其最新版本适月于本标准。GB/T20195动物饲料试样的制备(CB/T201052006,IS0 6498:1998.IIT)3原理
试中黄曲镶毒素B酶标黄曲霖毒素B,抗原与包被于微量反应披中肉黄斯震毒素B：特异性抗体进行免疫亮争性反应，府人嗨底物后显色，试样中黄曲霉毒素3：的含量与颜色或反比。用[测法或仪器汰通过与黄曲霉声素B：标准溶液比较判断或计算试样中黄曲霉毒素B：的含。4试剂和材料
除非另有说明，在分析中仅使用确认为分新纯的试剂和蒸馏水或去离子水或柑纯度的水，4.1黄曲霉毒素 B：联免按测试盆中的试剂注意：不同测试盒制造商间的产品组成和操作会有细微的差别，应严格按说明书要求规范操作，4.1.1包被抗黄面霉毒素B,抗体的聚米乙烯微鼠反应板。4.1.2样品稀释液：甲醇-蒸溜水（7+93)4.1.3黄霉薛素B标雅溶1.00g/[50.00g/L警告一一凡接触黄曲霉毒素B, 的容器,需浸入 1%次氨酸钠(NaCl0,)溶液.12 h后清洗备用，为分析人员安全，操作时要带上医用乳胶手套，4.1.4标黄而毒声素B抗原：黄出霉毒素B-辣根过瓦化物酶交联物。4. 1.50. 01 mol/L pII7. 5 磷酸趾缓冲液的配制:称取 3. 01 磷酸氧钠(NazHPO.12H,O).C.25g磷酸二氢钠(NaEI,P(),2H.O)、8.76g氯化钠(NaCl),咖水溶解至1L，4. 1.6酶标黄而霉萨素 B, 抗原稀释液;称取 0.1 g 牛血清白蛋白(BSA)溶子100 mI-pH7. 5磷酸盐缓冲羧（4.1.5）。
4. 1.70.1 tuol/1. pH7. 5磷酸盐缓冲液;称取 30.1 R磷酸氢二钠(NazHP0.[2H,O),2.5 g磷酸二氢钠(NaH,P().·2H,O),87.6 g氯化钠(NaC1),加水溶解垒1 L，4.1.8洗涤母液:吸取0.5 mL 叫温-20于:1 000mL0.1 mo/LPH7.5磷酸较盐冲(4.1.）4. 1.9pH5. 0 乙酸钠-柠檬酸缓冲液:称取 15.09 g 乙酸钠(CII,COONa·3H,O).1. 55 柠檬酸(C.HOHzO),加水溶解至 1 L。
4.1.10底物溶液 a:称取四巾基联苯胺(TMB)0,2 g溶于1 L PH5.0 Z酸钠-柠檬酸缓冲液。1
GB/T 17480—2008
4.1.11底物溶液h：1Lp115.0Z酸钠·柠酸缓冲液中加入0.3%过氧化氢溶液28mL。4. 1. 12终止液：硫溶液，:(H,S0),) -~2 mo1/L4.？甲醇水溶液：5tmL4醇加5mL水混合：4.3测试盒中试剂的配制
4.3.1酶标黄曲霍声素13，抗原溶液：在酶标黄曲需毒素B,抗原（4.1.1)中加入1.mL酶标黄曲霉毒紊B抗原稀释液（1.1.6），配成试验用酶标黄曲霉毒素B抗原溶液，冰箱中保存。4.3.2洗涤液：洗涤母液（4.1.8）中加300mL蒸馏水配成试验用洗涤液。5仪器和设备
5.1小型粉碎机。
5.2分样篇：孔径1.00mm，
5.3分析大平：感量0.01g，
5.4滤纸：央速定性滤纸，点径9rm10rtm5.5具案：角瓶：100mL。
5.6电动振荡器。
5.7微量连续可调取液器及配套吸头：10μL～100uL。5.B恒温落养箱、
5. 9酶标测是仪:内置 450 nm 滤光片。6分析步骤
6. 1 试样制备
按GB/1 20195要求制备试样。试样需通过孔径1.00 m:n的分样筛。如果样品脂肪含量超过10头，在粉碎之前用石油醚脱脂。在这种清况下，分析结果以未脱脂样质量计。
6.2试样提取
6.2.1称取5 g试样(6.1).精确垒0.01g,置于100 mL具塞三角瓶(5.5)中,川入平醇水溶液(4.2)25ml.,加塞振荡10mtn-过滤，弃去1/4初滤被，再收集适量试样液，贴菜样品小离了浓度高，建议按照附录A的规定对试样滤液进行萃取。6.2.2根据各种饲料中黄曲霉毒素B,的限量舰定利黄曲带毒素B,标准溶液(41.1. 3)浓度,用样品释液(4.1.2)将试样液(6.2.1)适当稀释，制成待测试样稀释液。如果黄曲需毒素B：标准游被浓度为1.00名/L时，建议按照附录B的规定稀释试样，6.3限量测定
6. 3.1试剂平衡：将测试盒(1.1)于室温中政置约 15 min,平衡至室温。6.3.2测定：在微量反应板（4.1.1)上选一孔，加入50μl.样品稀释液（4.1.2）、50μL酶标黄曲需毒素B抗原稀释液（4.1.5)，作为空白孔；根据需要，在微量反应板（1.1.1)上选取适量的孔，每孔依次加人50μl.黄曲霉毒B标准液(4.1.3)或试样液(6.2.2)。再每孔加人50 pL酶标黄曲霉每素Bl抗原溶被(4.3.1)。在荡器(5.6）1.混合均匀。放在 37 ℃恒温培养箱(5.8)中反应30 min。将反应摄从培养箱中取出·用力甩干，加250pL洗涤液（4.3.2)洗板4次，洗涤液不滋出，每次间隔2min，甩掉洗涤液·在吸水纸上拍干，每孔各加人50 μL底物猝a(1.1,10)和50μL底物溶液h(4.1.11)，摇勺。在37℃恒温培养箱（5.8）中反应15min，每孔50μL终止液（1.1.12），在显色后30nir内测定。6.3.3结果判定
6.3.3.1日测法：比较试样液孔与标准溶液孔的颜色，若试样液孔颜色比标准溶液孔浅者，为黄曲需毒素B，含最超标;荠相当或深者为合格，GB/T 174802008
6.3.3.2仪器法：用酶标测定仪（5.9），在450nm处用空白孔调零点，测定标准溶液孔及试样液孔吸光度A值,若 A泌孔小于 ^标非游浓H·为黄曲霉毒素 B，含量超标;若 A这样深元,大丁-或等于 A标准推H为合格。
6.3.3.3若试样液中黄曲霉毒素B含量超标，则根据试样液的稀释倍数，计算黄曲莓毒素B的含量。6.4定量测定
若试样小黄出霉毒素B，的含量超标，则用嗨标测定仪（5.9)在150nm波长处进行定量测定，通过绘制黄曲霉毒索 Bl的标曲线来确定试样中黄曲寇毒素B：的含最。用样品稀释液（4.1.2)将50.0μg/L邮爵毒素B标准浴液（4.1.3）稀释成0.0μg/L、0.1g/L、1.0\g/1.、10.0μg/L、20，0P多/150.0/L的标.作落浓，按限量法测定步骤测得相版的吸光厚值，以0.0费曲霉毒素B,标准工作落液的吸光度值A。为分母，其他浓度标准工作济液的吸光度值A为分子的比值，再乘以100为纵坐标，对应的黄曲带毒素B，标雅工作溶被浓度的常用对数值为模坐标绘制标曲线，根据试样A/AX100的值在标雅曲线上查得对应的黄曲声素I3，的含量试样中黄曲霉毒素B:的含量以质量分数X计，单位以微克每千克（多/kg)表示，按式（I)计算，x=oxVxn
从标准曲线上套得的试样提取液叶觉西靠毒素B含量，单位为微克你开（/）：V试样提液体积，单位为毫升(Iu1L)；n一试样蒂释倍数；
m--试样的质量.单拉为克（g）。计算结果保留2位有效数。
7精密度
施复测定结的相对偏差不得超过10。+-..( 1)
CB/T17480—2008
附录A
（资料性附录）
浓缩饲料的提取方法
称取1C §试样(6.1),精确至 C.01 g,置子 100 nL 具塞三角瓶（5.5)中,加人甲醇水猝液（1.2)50 L.加塞振荡15 min,过滤，弃去1/4初滤液底i收集滤液。准确吸取[0.C mL滤液（相当于2.0Gg样品)于125nL分液漏-斗rlt,加人20 InL三氯甲烷.加塞轻轻振摇3Iin，静置分层，放出三氯甲烷层，经髓有5g预先用三氯甲烷湿润的无水硫酸钠的快速定性滤纸过滤至 100 ml.蒸发M中,再加5 ml 三氯甲烷于分液斗中,重复提取，三氯中烷层并于蒸发Ⅲ中,最后用少量三氯甲烷洗涤滤纸洗液并人发川Ⅲ中,65 ℃:水浴挥干。准确加入 1C.0 mL甲醇水溶液（4.2)，充分粢解蒸发血中残渣，得到试样液4
附录B
(资料性附录）
试样液的蒂释
GB/T 17480—2008
如果黄曲霉毒素 B, 标准溶液浓度为 1. 00 1g/1. 对,按表 B. ］ 用样品稀释液(4. 1. 2)将试样滤液(6.2.1)稀释，制成得测试样稀释液，若试样被中黄曲毒素B,含超标，则根据表B.2中试样液的稀释倍数,计算黄曲霍声素B，的含鼠，表B.1样品溶液的稀释
饲巾黄由带素B,网量/(rg/kg)
试拌滤液量/InL
样品帮释羧过/ml.
稀释倍数与结果计算
稀释倍数
稀释佑数
GB/T17480-2008
中华人民共和国
国家标滩
饲料中黄曲霉毒素B,的测定
酶联免疫吸附法
GB/T 17480 20C8
中国标准出版社出版发行
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电话：6852304668517548
中国标难出版社秦皇品印刷厂印制各地新华书店经销
开本880×1231/16
2019 年 1月第一版
印张 C. 75 字数 11 千字
2009年1月第一次印
书号：1550661-35442
定价14.00
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