【国家标准(GB)】 饲料中黄曲霉毒素B1的测定 半定量薄层色谱法

ICS 65. 120
十中华人民共和国国家标雅
GB/T8381—2008/IS06651:2001
代替GB/T83811987
饲料中黄曲霉毒素B的测定
半定量薄层色谱法
Determination of aflatoxin B, in animal fccding sluft's-Semi-quantitative thin layer chromatographic methods(Is0 665l:200l,Animal fecding stuffs Semi-guantitativcdctcrmination of aflatoxin BrThin laycr chromatographic methods,Il)T2008-11-21发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
数码防动
2009-02-01实施
规范性引用文件
分析步骤
计算和结果表示
实验室间试验
试验报告·
隔录A（资料性附录）
实验室问试验结果
GB/T 8381—2008/1S0 6651:2001前言
GB/T 8381—2008/ISO 6651:2001本标准等同来用国际标准IS()651：2001&饲料中黄曲寄毒素B，的半定量测定薄层色谱法\（英文版）。
本标准等同翻译ISO6651:2C01.为使于使用做了下列编辑性修改：标准中文名称修改为“饲料中黄曲霉毒索B，的测定半定量薄层色谱法》；删除广国际标准的前言；
·一一将“本国际标准\改为“本标准”；用小数点符号“\代替小数点符号“，”在引用文件中，用\GB/T20195动物饲料试样的制备\代\ISO6498”；-在引用文件中，增加“GB/\114699.1饲料采样”：—-对图2中的展开方向符号进行了更正，将“I\改为\Ⅱ”“Ⅱ\改为“」”。本标准代替GB/T83811987&饲料中黄曲霉毒素B，的测定方法”。本标准与 GB/T 8381--1987相比，主要变化如下：在试剂条款中，删除黄曲需毒素13，标准溶液制备时仪器校止内容，并增加黄曲霉毒素B，三熟甲烷标准溶液制备与浓度测定；：层折时可选择的展左剂种类由两种增至五种：一方法A……单向薄层色增法中,增加不同体积的标准溶液和样品液的点样点；方法B双向薄层色谱法中，减少辅助板的数量，并月点样的分布方式不同：检测中增加薄层扫拍仪荧光法；--—-确证试验中增加硫酸推测试验。本标准的附录A是资料性附录。
本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出并归口。本标准起草单位：江苏省微牛物研究所有限责任公司。本标准主要起草人：宓晓黎、李利东、袁建兴、杜姝莲。本标准子1987件首次发布，本次为第-次修订。1范围
GB/T8381—2008/1S06651:2001
饲料中黄曲霉毒素B，的测定
半定量薄层色谱法
本标准规定了荷料中黄曲霉毒素B，的两种测定方法，并只能用于半定量测定，本标准中的方法A适用于油籽和油籽柏,花牛、椰了仁，亚麻仁、人克、棕榈仁、木薯淀粉，玉米粘、谷类和谷类制品、豌豆粉、上H渣和上豆粉等单一饲料产品。当使用方法A测定上述某个单-饲料受下扰时,建议使用方法 B。
本标准巾中的方法B适用于配合何料以皮上述未提及的单-·何料。本方法不适用于含柑橘渣的简料。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标的引用而成为本标雅的条款，凡尼注日期的引用文件，其随所所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标谁达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注印期的引用文件，其最新版本适用于本标雅。GB/T14699.1料采样(GB/T14699.1 --2005.ISO 6497:2002.IDI)GB/T20195动物饲料试样的制备（GB/T20[952006,ISO6498：1998,IDT）3原理
试样黄曲霉毒蔡经三氧中烧提、过滤，收柱纯化，浓缩，用-定体积三氯甲烷惑苯-乙混合液溶解残湾。用单向薄层色谱法或双向薄层色谱法进行试液层析分离。在紫外灯下检查色谱荧光斑点，在同一板上，试液与已知标推黄曲霉毒素B，比较，用月测法或薄层扫描仪荧光法测定黄曲需萨素B含量。以形成半缩醛衍生物来确证黄曲需毒素B。4试剂
在分析中使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。4.1三氧甲烷：用0.5%～1.0%的95%7.醇稳定，4.2正上烷，
4.3无水乙醛，无过氢化物。
4.4苯-7.腈(98+2)混合液;98mL苯与2 mL乙睛混合，4.5三氯甲烷-甲醇（9713)混合液：97ml.三氯甲烷与3ml.甲醇混合。4.6展开剂：使用带盖展开，展精内壁衬「吸水纸·使展开精被展开剂饱利。4.6.1三氯甲烷丙酮(90→10)混合液：在未饱和展开槽内.90mL三氯甲烷和10mL丙酮混合。4.6.2乙醚-甲醇-水（96+3+1）混合液：在未饱和展开槽内.96ml.乙醚、3ml.甲醇和1ml.水混合。4. 6. 3乙醚-甲醇-水(94十4. 5十1. 5)混合液:在饱和展开槽内,94 l. 乙醚,1. ml. 甲醇和 1. 5 L 水混合。
4.6,4三氯甲烷-甲醇(94十6)混合液:在饱和展开槽内,94 mL三氯甲烷和6 mL甲醇混合。4.6.5三氯甲烷-甲醇（97卜3）混合液：在饱和展槽内，97ml.氯甲烷和3mL甲醇混合。4. 7 硅胶:柱层析用,0. 05 II~(). 20 m[m 粒径。4. 8违胶G:薄层色谱用。
GB/T 8381—2008/1S0 6651:20014.9酸洗硅藻土。
4.10无水硫酸钠。
4.11三氟乙酸。
4.12情性气体：如氮气，
4.1350%硫酸溶液（体积分数）。4. 140,1 μg/ml. 黄曲霉素 B,标准溶液:用=氯甲烷(4. 1)或苯-乙睛混合液(4. 4)配制。替告一一黄曲霉毒素是高致癌性物质，应十分小心处理，依下列各项制备和核对黄曲霉毒素B溶液。4.14.1储备液的制备与浓度测定用=氯甲烷(4. 1)或苯-乙腊混合液(4. 4)配制的黄曲霉毒素 B, 标准溶液,其浓度在 8 μg/ml. ~~10 μg/ml. 之间,用紫外分光光度计(5. 9),在 330 rml 和 370 nm 之间测定吸收光谱。对黄曲霉毒素 B, 三氯甲烷溶液,在 353 nm 处测定吸光度值(A)，或对黄曲霖萨素 B,苯 Z,腈混合溶液，在348nm处测吸光度值（A）。黄曲霉毒素B：的浓度数值以微克衔毫升（μg/mL）表示,按式(1)或式(2)计算
a）黄曲霉毒素 Br 三氯甲烷溶液,黄曲群奔素B,三氯甲烷潜液浓度312×A×1000,22 300
b）黄曲霉毒紫Bl苯-乙腈混合溶液：黄曲都毒素B*-乙肪混合溶液浓度 312XAX100019800
4.14.2稀释
..--( 1 )
在避光条件下,将储备液(4.14.1)适当稀释至0.1 μg/ml.黄曲霉毒素B,标准溶液。如果在 4C冰箱存，此济液两周内是稳定的。4.14.3储备液色谱纯度试验
取 5 μI. 8 μg/ml~1C μg/ rul. 黄曲鑫毒素 B 标准溶液(4, 14. 1)点加 于薄层板上(5. 7),按 7. 5. 1层析-在紫外灯下色谱只显-斑点，在原点处无明显荧光。4. 15 用于定性试验的黄曲毒素 Bl 和 Bz(见 4. 14 替告)溶液为约含 0. 1 μg/ mL 黄曲霉毒素 B, 和1B的=氯用烷.1)或莱-z睛混合溶糖4.4)：所给出的浓度为指导性度，应调节两种黄曲霉毒素浓度以获得相同的荧光强度（7.5.1)。5器
5.1研磨机/混合机。
5.2分择筛:孔径 1.0 mm。详见 IS0 565″5.3振荡器或力搅拌机
5.4色谱玻璃柱：内径22mm，长300mm，下带聚四氟乙烯活塞，t:有250 ml.贮液器。5.5旋转真空浓缩器：带500ml.圆底烧瓶，5.6薄层色谱设备：薄层板(5.7);点样器（毛细管或微量移液器）:展开槽:用丁硫酸液(4. 13)显色的喷雾器。
5.7玻璃游层板:200 nmX20umm，按以下方法制备，可铺5块板，置 30 g硅胶(4. 8)于三角瓶巾,加 60 mI. 水,加瓶差振摇 1 rmin,涂布于板上,0. 25 rmr 厚,空气中下燥，然后贮存于含胶的下燥器巾，用时110℃活化1h。也可用具有相间性能的预制板。5.8紫外光灯：波长360nm。
1）IS0)565试验用筛金属丝织网布、多孔金属板利电加工成形的薄板孔径尺寸的公称2
GB/T 8381—2008/IS0 6651:2001灯距薄层板10 cm 时，照射强度应使 l.0 ng贵曲霉毒素 B斑点能被清晰分辨。警告—紫外光对眼睛有害,应戴防护镜。5.9紫外分光光度计。
5.10薄层扫捕仪：可荧光检测（可选）。5.11槽状滤纸。
5.1210.0mL带聚乙烯塞试算。
5.13500 ml.三角瓶：只磨口玻璃塞5. 1450 mL移液管。
5. 15分析天平-。
6来样
按照GB/T 14609.1采集实验室样品7分析步骤
7.1试样制备
7. 1. 1如果样品脂肪含量超过 5%,在粉碎之前用石油醚脱脂。 如果经悦脂,分析结果以未脱脂样品计。
7.1.2粉碎实验室样品，全部通过分样筛5.2），充分混合，详见GB/T20195。7.2试料
称量制备试样50g，精确至0.01g，置于锥形瓶(5.13)中。7.3提取免费标准下载网bzxz
加25 g巍±(1. 9).用量筒准确量取25 mL 水,250 mL三氯甲(4. 1)至试料(7.2)中，加瓶塞，用振荡设备(5. 3)振摇或搅拌 30 min，通过槽状滤纸(5.11)过滤，弃10 ml.初滤液.随至少收集50 mL液.
7.4柱纯化
7.4.1柱的制备
2/3柱体积的三氯甲烷(5.4)到层析柱中,加5名硫酸钠(4. 10）,使硫酸钠层表面平整,分次加人10 g硅胶（1.7),如有气泡时，小心搅动，静置15mi，再小心地加10g硫酸钠(4.10),打开活塞,让液体流出，直至液体恰在硫钠层的上表面,关闭活塞。7.4.2纯化
用移液管（5.14)吸取50mL收集的滤液（7.3）至250mL铠形瓶中，加100mL正已烧（4.2），抿合，把混台量地转移至层析柱中，用正已烷洗涤锥形瓶，并倒人柱中，打开活塞+使羧体以8 mI.,/mⅡ~12m11in蔬速流出，直至液体在蔬钠层的上表面，笑闭活塞，那05mI乙醛（4.3到柱中再打开括塞，直到液体流出至酸钠层上表而。弃去流出藏体。在整个操作过程中，保证任不干用150mL三氯甲烷-甲醇混合液（4.5）洗脱柱子，收集全部洗脱液到500mL旋转蒸发瓶（5.5)内，用旋转蒸发器在情性体(4,12)保护下,50℃以下减压蒸馏至于。如果旋转蒸发器不适用，可加助沸剂在水浴中蒸发至下。用三氯中烷(4.1)或苯-乙混合液(4.4)转移残留物至 10 mL试管(5.12)中,置于水浴中,通性气体(4.12).再蒸发此溶液。用三氯甲烷(1.1)或苯-乙睛混合液(4.1)定容至2.0mL。7.5薄层色谱
7. 5. 1 方法 A—～单向薄层色谱法7.5.1.1选择展开剂
预先配制选择的溶剂(4.6.1、4.6.2、1.6.3、4.6.4或4.6.5),保证黄曲霉毒素B,与B2在薄层板13
GB/T B381—2008/IS0 6651:2001展开后完全分离，其结果也取决于所用薄层板的批号。点25μL定性溶液（4.15)在一薄层板（5.7）上，按7,5.1.2展开,挥发，照射。用合适的溶剂会产生两个明显点。7.5.1.2操作步骤
取TLC板，在距薄层板下端30mm的基线上用毛细管或微量注射器点样，衔点问隔201nIn.黄曲蒋靠素B：标推溶和试液的点样体积妇下：-10μI.,15μI.,20μl.,30μL,10μL黄曲帮毒素B标准溶液（4.14);-10μL试液（7.4.2）,在同点，20 μ.黄曲毒素13:标准液；10 μL,20 μL试液(7. 4. 2)。在暗处用所选择的展开剂展开(7.5.1.1)，从展开中取出板，置赔处蒸发溶剂，然后在紫外灯下检查,板置于灯(5.8)10 cm处,黄曲霉毒素 B 斑点显蓝色荧光。7.5.2方法到——双向薄层色谱法7.5.2.1点样(见图1)
在板1画两条直线乎-行于两个毗邻的边，分别距每边50mm和60mm，建立溶剂前沿迁移限线，用毛细管或微量注射器点下列溶液：在 A 点,20 μL 试液(7. 4. 2);在 B点,20 μL黄曲霉毒素 B.标准溶液(4. 14);衣 C点，10 μL 黄曲薛靠素 B 标准溶液(4. 14);衣 D点,20 μI. 黄曲毒毒素 B 标准溶液(4. 14);在E点，40μL黄曲毒素B 标雅溶液（1.14)，用空气或惰性气体慢慢吹干，斑点的直径约5tntn单位为毫米
图1点样示意图
7. 5. 2. 2 展开(见图 1)
GB/T 8381-—2008/IS0 6651:2001在赔处，用展开剂(4.6.3)(在饱和展开槽中约1 cm厚)按力向I展开至溶剂前沿限线取出展开槽中板：挥于，宰湿放置在暗处至少15 mir，然后在暗处用展开剂(1.6.1)(在非饱和展开槽中约 1 cm厚)沿方向 T展开至溶剂前沿限线，从展开槽巾取出板，在室温、暗处挥干7.5.2.3色谱解析（见图2）
将薄层板置丁紫外灯(5.8)10cm处检查色谱，标记B、C、D、E标准溶液中黄曲需寿素B，的蓝色茨光斑点。
通过 F、D,C和 B间两条分别平行丁两个展π方向的假想线,相互乘直并相交于 P点,P 点为点A中黄曲霉毒素B,荧光斑点的理论位置，但是实际上点样A中黄曲霉毒素B，的荧光斑点可能位于Q点.使得Q点分别与 C点,B点连成的直线成100°角，XE
图2色谱解析
7.5.2.4附助色谱
在新极1，画两条直线乎行于两个毗邻边，如图1所示，在A点·点20αL试液（7.4.2）.叠加点20 L黄曲霉薛素 B,标谁溶被(4.14）,按7.5,2.2展开，在紫外灯下检查色谱并核食试液中的黄曲霉毒素 斑点与标准溶液中的黄曲霉毒素BI斑点叠加;此点的蒸光强度比第一块板Q点处的黄曲薛素印点荧光强度更强，7.6检测
7. 6.1目测法
7.6.1. 1方法A
通过试液荧光斑点与标准溶液荧光斑点比较，测定试液中黄曲霉毒素B，的量。试液加标准溶液的点所获得的荧光应该比10 uI. 试液点更强，并且应是只显示一个斑点，如果10μL试液给出的荧光强度反而比40 μ.标准溶液更强，在重新薄层层析之前,应该用三氯中烷(4.1)或苯乙睛混合液（4.4)稀释试液10倍或100倍，5
Gh/T 8381—2008/iS0 6651:20017. 6. 1. 2方法 B
退过试液斑点荧光强度与C、D和E标准溶液的斑点荧光比较，测定试液中黄曲毒素B,的量，如果 20μL试被所显荧光强度比 40 μL标准溶液更强，在重新进行薄层层析之前，用兰氯甲烷(4、1)或举-乙睛混合液(1.1)稀释试液10倍或【00倍。7.6.2薄层扫描仪荧光法
在365m激发波长，443nm发射波长下，用薄层扫描仪（5.10）检测黄曲霉毒素Bl斑点的荧光强度。
作用方法A的情况下，通过比较标准溶液的斑点荧光强度测定试液斑点中黄曲霉毒素B，的量。在用方法B的情况下，通过比较标准溶液C、I)和E的斑点荧光强度，测定试被斑点中黄曲霉毒I3:的最。
7. 7 黄曲霉毒素 B, 确证试验
7.7.1通则
用硫酸推测试验(7.7. 2)验证鉴定试液中的黄曲毒素 B,,如果测试结果为阳性,用有效的确证试验（7.7.3）。如果硫酸推测试验结果为阴性，这种情况提示黄曲霖毒素B，不存在，不需要实施有效的确证试验。
7.7.2硫酸推测试验
喷硫酸溶波（1.13)在7.5.1或7.5.2状得的色谱上，在紫外灯下，黄曲毒素B,荧光斑点应出益色转为黄色。
7.7.3确证试验
7.7.3.1半乙酰化黄曲霉毒素B的形成（黄曲霉毒素B2）对单或有轻微额色的饲料，用7.7.3.2描述的单向薄层色谱方法，对单一额色饲料、配合何料或有疑问情况下,用7.7.3.3描述的双间薄层色谱方法，7.7.3.2单向薄层色谱法
乍板（5.7)F.划：-百线将板分成两个均等份，在每一份上，避i底边缘20mm处点样，点距15mm，黄曲霉毒素Bl标准溶液和试液点样休积如下：..25μL黄曲带毒素B，标准溶液（4.14)；试滋(7. 1.2)的体积含约 2. 5 ng黄曲毒毒素 T3 ;—25μL黄曲霉素B,标准液（4.11),在此点上叠加点试被(7.1.2),相当于2.5ng黄曲霉毒素B，的体积。
在其中一个1/2钣[,在先前点的斑点,:登加点1 PL或2 μL三氟乙酸(4. 11),在室温下用空气流干燥。
在暗处，用一种展开剂（1.6）开层析，事先选择好此展开剂，溶剂系统应保证半乙酰化黄曲霉毒素B，与干扰物清晰分离,溶剂前沿应达120 mm处，作暗处挥发溶剂,然后将硫酸溶液(1.13)喷在没有用三氟乙酸处理的板部分，在紫外灯下检查薄层板。
黄曲霉毒素 B, 鉴别确证:,如果a）试液中黄曲毒素B:衍生物的R：值与标准溶液的R值相当b）标准溶液加试液中黄曲霉毒素BI衍生物荧光，比试液中黄曲霉毒素B衍牛物的荧光更强，由于试液荧光斑点与半乙酰化黄曲霉毒素B，荧光斑点有相同R：值，可能导致色谱的仪性于扰这些现象用硫酸处理的板部分捡查。如果有疑间,应该用双间薄层色谱法(7.7.3.3)确证。6
7.7.3.3双向薄层色谱法（见图3）7.7.3.3. 1点样
GB/T8381—2008/IS06651:2001
在板（5.7)上划两条直线，乎行于两边边缘（距每边5Cmm),建立济剂前沿迁移限线,用毛细管或微量注射器点下列溶液：
在A点：点试液(7. 4.2),其体积中档当于含 2.5 g黄曲霉毒索 Bi.滴加1 μL~2μL 三氟乙酸(4. i1)t
一在 R点和 C点:点 25 μI. 黄曲霉毒素 13, 标准溶液(4. 14),滴加氟乙酸(1. 11)。室温空气流干媒。
7.7.3.3.2展开
如阁3所小,在暗用开剂（4.6、2)（在非饱和搏1m厚外)按方工展开至痒剂前沿限线：从槽联出板，在赔处室温于燥5 min。在暗处用展开剂(4. 6. 1)(在非饱和增 1 cm 厚处)按方向 II 展开至前沿限线,取出板,在室温下燥。
7.7.3.3.3色谱解析
在紫外灯(5.8)下检查色谱，核查下列特征：a）显示来白点在C处(方向「移动)和点在B处力向Ⅱ移动)的标准溶液中半艺酰化黄曲毒索B：蓝色炭光斑点，向时显示有末与“氟乙酸反应的黄曲霍毒素B弱的监色茨光斑点。I）显示点在A处试液中类似子a)指述的斑点,这些点的位置通过点在B和（处的标准溶液产生的斑点鉴别,来自试液中的半乙酰化黄曲霉毒素 B, 斑点荧光强度与点在 B和 C处标雅落中的应该是可比较的，
单位为旁米
图3点样示意图
GB/T 8381-2008/ISO 6651:20017.8检测数量
相同试验样品进行重复检验。
计算和结果表示
8.1目测法
试样中黄曲霉声素B,的含量(X:)以微克每丁克(μg/kg)表示,按式(3)计算：X, =exvixV
式中：
黄曲霉毒素B,标准游液(4.14)的浓度（约0.1μg/mL）.单位为微克每熹升(μg/ml.)；社纯化用提取液的体积所相当的试料质壁（10.0g），单位为克（g）；V
提取波最终体积(必要时进行稀释）,单位为微片（μL)：分别为试样体积和具有类似荧光强度标准游被的体积,单位为微升（μL），8.2薄层扫描仪荧光法
试样中黄曲霉毒素B：的含鼠(X.)以微克每千克(μg/kg)表示，按式(4)计算：Xg = m ×V
以V，体积计算，从测定中推算山的提取液延点中黄曲霉毒素B，的质负，单位为纳克（ng）)；V，—-提取液最终体积(必要时考虑稀释),单位为微升(μL);m-：柱纯化用提取液的休积所相当的试料质量（10.0g），单位为克（g）；V点到板上的提取液体积(10 μL或20 μL),单位为微(μ1.)。9
实验室间试验
实验室间试验力法精密度汇总于附录A。实验室而试验获衔的值可以不适用于附录A末列出的浓度范围和基质
10试验报告
试验报告应给出的内容：
样品测定的所有必要信息；
如果已知使用的采样前法；
使用本标准提及的试验方法A或方法 I3;检测方法（口测法或薄层扫描仪荧光法）；在本标谁中没有详细说明的所有操作方法或认为选择可能影响试验结果的任何事件的捕述；试验结果。
附录A
（资料性附录）
实验室间试验结果
GB/T 83812008/IS0 6651:200
配合简料(方法 13)的三组实验室间问试验,其中两组完成在国际水平(No. 1 和 No, 2),其结果如表A.1所示。
试验2中11个实验室也按方法A分析广样品，其饲料组成适合于方法A,用口测或薄层扫描荧光法所获得的数据与方法B类似。
表A，1实验室间试验结果统计
参加实验室的数石
平沟值/(pg/kg）
重复性标准差(（5.)/（\g/kg)事复烂变异系数/
重复性限(2.83S.)/(μg/kg）
现性标推(S)/g/kg)
再现能变异系数/%
再现件限(2.83.5)/（μ/kg)
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