【国家标准(GB)】 三疣梭子蟹

ICS 65. 150
中华人民共和国国家标准
GB20556—2006
疣梭子蟹
Swimming crah
2006-09-29发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2006-12-01实施
标准技授网WW.bzsosO.cOm各实标准行业资科免费载前
本标准的5.1和5.2为强制性条款，其余为推荐性条款，本标准的附录A,附录B为规范性附录。本标推由中华大民共和国农业部提出。本标准山全国水产标准化技代委员会海水养殖分技术委员会归口。GB 20556—2006
木标推起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所.中国海洋大学，山东省渔业技术推广站。本标推主要起堂人：张岩、于东祥、陈四渣、孔晓瑜、李色晶王春生具
标准技授网各实标准行业资科免费载县贵
1范围
疣梭子蟹
GB20556—2006
本标准给出了三疣梭子蟹（PortunustritubeculatutMiers)的正要形态构造特征，生长与繁殖特征、生化遗传学特征、分子牛物学遗传特征以及检测方法。本标准适用于三疣梭于蟹的种质鉴定和捡社2术语和定义
下列术语和定义适用于来标推。2.1
全甲宽full carapa
成体型二统榜一
甲宽carapa
成体型三疣
3名称与分类
3.1学名
三疣梭子
3.2分类位置
御最来
头胸甲最
甲壳纲(Cltac最a）、十目
4：分布与生态
三疣梭子蟹
性多年生
质潮闻带海滩广阔的店海水域分等：这些地力都形成了市
性。养在池塘中的三舞梦
倾斜倒乘于水中，第5
壁渔记
D、梭子蟹属Por匙
作律宾等施均骨分布，尤其是在沙泥、闽湛海及日本的濑户内海
柔觅食并有明显的趋光
出日落时有比较明显的骨夜垂青移动倾象。兰疣梭子蟹游劫时，身体
腰动，作横向或不定向的水平游动，潜入钞时，常与池底虽15°～45°的交角，仅露出眼及触角，
子蟹无钻洞能力。
梭于蟹属于杂食性动物，名
高欢摄食贝再解朵值。小案杯等，也摄食水菜芽，海生动物口体以及腐烂的水生植物。而且不同生长阶段食性有所差异，在幼蟹阶精于杂食性，个体愈大愈趋向肉食性。通常白天摄食量少，傍晚和夜间大盘摄食仙水温在9斑下和82℃以上时，梭子邂停止摄食：5形态特征
5.1外形
头胸甲呈梭形，背面火部为茶绿色，后缘和斥侧缘呈紫色，并有灰白色斑点分布，腹面均为灰白色；螯足发达，长节呈棱柱形，内缘具钝齿，足背面紫色，具灰白色斑点：前3对步足莅色，指节紫色。第4对步足掌节和指节扁平、宽薄；背面除指节外其庆白色斑点：腹部扁平，雄蟹腹部呈三角形，雌蟹呈隧形。三疣梭子蟹的外形态见图1
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5.2可数性状
三疣梭子蟹外形
5.2. 1头胸甲表面有 3 个显著的疣状降起,1 个在胃区,2个在心区。5.2.2头胸中两前侧缘各具9个锯状齿，第9齿特别长大。5.2.3额缘具2枚～6枚小齿，一般4校;前侧缘斜拱形，长于后侧缘。5.2.4额部两侧有1对能转动的带柄复眼。5.2.5胸足5对。
5.3可量性状
成体型三疣梭子蟹的甲宽与全甲宽的关系见式（1）,式（2)：雄蟹W=0.080 1XL—0. 120
雕蟹：W-0.0793×t--0.029
式中：
一中，单位为毫米(mm)；
全用宽，单位为毫米（mm）。
6生长与繁殖
6.1生长
6.f.1生长
三疣梭子幼蟹以后每次蜕皮的体重增长如图2所示，每蜕皮一次约增重 2.8倍。在趣年（两年）养成中,经冠 2次~-3欲蜕皮,甲宽这 18 cm 以上,体重最大可超过 1 kg。550+
X为皮
经过天数/天
三疣梭子蟹的生长
好数静
标准技授网各实标准行业资科免费载6.1.2不同蜕皮龄期与全甲宽及湿世的关系不同蜕皮龄期与全甲宽及湿重的关系见表1。表1三疣梭子不同蜕皮龄期与全甲宽及湿重的关系锐皮龄期
全宽/
禄重/
注：C为动蟹或成体显,C1 为1蜕皮龄疑,其他类推。6.1.3全甲宽与体重（湿重)的关系蜕皮龄期
三疣校子全甲宽与体重（湿重)关系式以式(3)表示：W - 0. 058 8L:
武中：
一体量（湿重），单位为克（g）L—全用宽，单位为匾米（cm）。6.2攀殖
6.2.1性成熟年龄
全甲宽/
GB20556—2006
三疣梭子蟹雌雄异体。雌性和雄性个体，均在其成休型的第12龄期或第13龄期达到性成熟：6.2.2生物学最小型
野生三洗梭子氧雌、雄的生物学最小型均为全甲宽13cm。6.2.3性腺发育周期
雄蟹在当年秋季性腺发育成熟，并与峄蟹交尾，雌蟹性腺从当年的秋季开始发育，到第二年的容季发育成熟产卵，一疣子进行多次产卵，·般产卵两次，大型雌餐可迹续产卵3次~-4次，个别可达5次，吞季解化出的幼蟹生长速度很快，当年休重长到150g左右即可达到性成熟，成为补充群体。冬眠后的雌蟹求年产卵后，可继续蜕壳生长，第三年还可产谢繁殖。雄蟹在第二年越冬洄游前大量死亡，6.2.4产卵量
三疣梭子蟹一次产卵的数量，同亲蟹的大小人体成正比，为80×101粒～150×10°粒，同雌蟹的抱卵数，第二批和第二批次与小于第一批次，例如，全甲宽为20cm的滩蟹，至产出第三批次的年产卵量，约为600×10粒～660×10°粒（见图3），标准技技网各实标准行业资科免费下载GB 20556—2006
6.2.5肇殖水温
全中宽/em
图3三疣梭于蟹的抱卵量
在勤海，了月是越年蟹交配的盛期，春夏之交是梭子蟹的警殖季节，三疣校子蟹的产卵活动集中分布于沿海河口附近。4月下们底层水溢升至14℃～26℃时开始产卵，在我国沿海产聊期由南向北向后推移。
生化遗传学特征
7.1主要同工酶的谱型
三疣梭子蟹肌肉中超氧化物歧化酶（SOD）、磷酸葡萄糖变位酶（PGM）、腺苷酸激酶（AK)向T.酶的电泳图谱分别见图4、图5和图6
图4三疣梭子蟹SOD电泳图谱（单）图5
三疣梭子蟹PGM电录图谱（多态）图6三梭子蟹AK电泳图谱（多态）7.2生化遗传特征
采用水平淀粉凝胶电泳技术，对10个三疣俊子蟹逊行了同工酶分析。在11种同工酶中共检测到厂23个基因位点。根据P。.多态位点判别标准：多态位点比例为14.7%；根据标准计算，平均杂合度观察值（H。)为0.086士0.018，平均杂合度期望值为（H,)0.103士0.011，平均有效等位基因数（N,）为1.375±0.117。
种年客静范经制
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8分子遗传学特征
GB 20556—2006
采用PCR技术、分了克隆技术及DNA序列测定技术，对三梭子的线粒体16SrRNA（核糖体16SrRNA)基因片段进行了PCR扩增（引物序列见“检测方法”）和序列测定，获得了长度为566bp的核苷酸序列。
16StRNA基因片段序列：
1 CUGGICIGAA
61 CIGCACTATA
CTCTGAGAAT
GATCAACTAA
TATACTTTT
TATAAAATTT
GCCTTTTCAC
ACCATTCATA
ATACCGCGGC
TAGACATGTT
检测方法
繁殖力的测定！
用下平或杆秤
的卵1,0g.在解剖！
式中：
CTCAGATCAC
GTAAAAAATTAAAGGTCGAA
AAGAUATTTTAATTCAACATCGAGGTCGCAAAATTACGCT
GITAIGROAAGTAACTTG
TTTTCTTTATPACAAAAACA
GTTGCCURA
聊前、后椎蟹
数，乎行两
产卵量位的粒：
一产卵前蟹质量，单位为
一产卵后亲解睡量，单位为
一—试样|的
数，单位为
试样1质量量
一试样2的卵繁
试样1质量
9.2生化遗传学特征的谦
9.2.1样品处理测定
喜为克（）
直位为
样本活体低温保存带回实整
将部分组织(约0.5)取出放）
CCCAATAAAT
AAAGCTTTAT
AATTCAATTT
ATTAAAAAAC
ATTGTAC
CAGAXTTCT
AACTTATTCT
ATCTITTAAT
TTTCTAGCAG
TTTCAAAAGATTATCAITAT
AGCETTAT
TAATGAAAGA
TAATGATTAT
后两次称量之
GCAGGCE
CETCOCTCTA
GACAGGTTTT
AGLIACATTTG
AGACTAAAA
TATATAGCTG
TTGATAACGA
CCGTTTCAGG
TTATTAATAA
TAAAAAAATA
AAATATCTAA
TCTITGTCGA
CACGGTCAAG
TACCCTCTAA
的的质最。
用电鲁天平称刚产出
量按式（4）计算：
活体懈剖取样后，密封放人超抵温冰籍（-76℃)或液氮罐中贮存。匀浆器甲加严科
（体积比质重>的0. 1mo1/L.鳞酸缓冲液(pI7.0),0.1 α1/L磷酸缓冲液的配置驱随录A。冰水浴中包浆后，倒人1.5mL离心管内，4C冰箱中据提0.5h~」h，然后在0℃-~4℃冷冻离心机甲01/min离心10min，离心后的上清疫作为电漾祥品。
9.2.2电泳分析
采用水平淀粉凝胶电泳方法，凝胶浓度为12%，TC制胶缓冲液见附录A。电泳缓冲系统为TC电极缓冲液（pH7.0),TC电极缓冲液的配置见附录A，恒流（中流大小为12mA)电泳12h。电泳过程在4℃冰箱中进行。凝胶厚度为6mm，电泳斥切成1片～5片，分别进行各种酶的染色，染色过程在37C栖溢箱中进行，同工酶染色液的宦制见附录B：9.2.3数据处理
数据处理见式(5)、式(6)、式(7)和式(8)。5
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多态位点比例（P）=（多态位点数/所测位点总数）×100%平均杂合度观察值（H）=多态位点杂合度观察值之和／观察位点总和平均杂合度期望值（H。）一多态位点杂合度期望值之和／观察位点总和平均有效等位基因数(N.）-
9.3分子遗传学特征的测定
9.3.1DNA提取
(N)n（其N1-H）
-（7)
取肌肉组织.尽量剪碎，册DNA提取试剂盒或常规酚方法提取基因组DNA，TE溶解后一20C保存备用，I溶的配置见附录A。
9. 3. 2PCR 扩增
16SrRNA 引酶 (16AR/BR)序列为5'-GCCTGTTTATCAAAAACAT3'(1GSAR);5'-CCGGICIGAACICAGATCACGT-3'(I6sBR)25μl.PCR增反应体积内含：2.0mmol/LMgCL2，0.2mmol/L每补dNTP,0.2μmol/L.每种引物，1μLDNA模，LTaq酶及×缓冲液。P尺反应程序为：94C预变性2min；94℃45s，50%1mi，72℃1min，循环35次最后72延伸5min.
PCR产物1.4必琼脂糖凝胶电泳.EB染色，凝胶成像系统观察、照相9.3.3PCR产物克隆
PCR产物间收纯化后，连接到T载体上：连接反应体积10μL其寸载体1uT，连按酶T5，PCR产物4μL，16℃连接1h或1℃过夜，然后连接液转化感受态大肠杆菌，涂平板，监-白班筛选阳性克隆,液体培养基培养,提纯质粒后用EcoRI征 Hindl IL酶切捡測有无插人乓段9. 3. 4序列测定
对间收质啦迹行测序反应，产物纯化后在DNA测序仪上测序：为保证测序的可靠性和准确性，采用双向测序，并进行人工核对、校正，10判定规则
检测结果不符合5.1和5.2要求的，则判定为不合格项：有不合格项的样品为不合格样品，数
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A.10.tmol/I.磷酸缓冲液（pH7.0)附录A
（规范性附录）
缓冲液的配置
GB20556—2006
0. 01 mel/L磷酸氢二钠铬液 57.7 mL,0.0l mol/1. 磷酸二氢钠溶液 12. 3 mL,加水至1 000 mL,pH7.0.
A.2TC 制胶缓冲液
三羟甲基氨基甲烷3.028g.用柠酸调pH至7.0,蒸留水定容至1LA.3TC电极缓冲液
三羟甲氨基甲烷 42. 65 &,用粹檬酸调 pH 至 7. 0,蒸馏水定容至 10 A,4TE缓冲液(pH8.0)
10mmol/LTrisHCl(pH8.0),1mmol/LEDTA(pF8.0)标准技授网各实标准行业资科免费下载CB20556—2006
附录B
(规范性录)
同工酶桀色液的配置
表B. 1给出了各同,工酶染色液的成分。表B.1同工酶染色液的配制
同T嗨
超氧化物
鼓化酶
磷酸葡萄糖
变位酶
英文名和缩写
Suprroxide desmutase
Phosphaglucxm-tase
Adeuylale Kiase
Tris-IICl
MTT(噻唑蓝）
PMS（盼嗪酮硫酸盐）
Triy-HCl
NADP(辅酶)
（6-磷酸葡萄糖脱氨醇
Gluose--phosphaie
(1-磷酸葡萄糖）
MT(噻唑蓝）
PMS(酚嗪甲酯巯酸盐）
Tris-HCl
NADP(辅醇）
葡萄糖
ADP二磷腺）
（6磷酸葡脱）
己糖激酸
MTT（唑蓝）
PMS嗪甲酯硫酸盐）
aL7han籍壁精筋
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D. 2 mnt/t.-plls, 5
0.2 arol/L,pH8. 0
0, 2 mol/L.plis, 0
1. 0 mol/L
轴纤餐静藏销
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o. I InL.
10 inL
0. 1 g--0. 2 g
11ng-20 ing
$ mg~3 mg
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