【国家标准(GB)】 海带

ICS65.150
中华人民共和国国家标准
GB20554—2006
2006-09-29发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
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2006-12-01实施
中华人民共和国
国家标准
GB20554—2006
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2006年12月第一版
2006年12月第一次印刷
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本标准的第3章为强制性条款，其余为推荐性条款。本标准的附录A为规范性附录。
本标准由中华人民共和国农业部提出。GB20554—2006
本标准由全国水产标准化技术委员会海水养殖分技术委员会归口。本标准起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所、中国科学院海洋研究所、中国海洋大学。本标准主要起草人：王飞久、段德麟、刘涛、陈四清、张岩、高淳仁、于东祥、崔竞进。1范围
GB20554—2006
本标准给出了海带（Laminariajaponica Aresch)的名称与分类、主要形态构造特征、生活周期与繁殖、遗传学特征以及检测方法。本标准适用于海带的种质监测和鉴定。2名称与分类
2.1学名
海带(Laminaria japonicaAresch)。2.2分类位置
褐藻门（Phaeophyta）、游孢子纲（Phaeosporeae）、海带目（Laminariales）、海带科（Laminariaceae）、海带属（LaminariaLamx.）。
3主要形态构造特征
3.1孢子体外部形态特征
藻体明显分为固着器、柄和叶片三部分。海带孢子体外部形态见图1。1
固着器；
一柄；
一叶片，
一纵沟，bZxz.net
中带部：
一叶缘部。
图1海带孢子体的外部形态
，3.1.1固若器
由多次双分枝的圆柱形假根组成，其末端有吸盘。3.1.2柄
呈圆柱形或扁圆柱形，深褐色，成藻柄长3cm～6cm。3.1.3叶片
带状，褐色具光泽，基部幼时楔形，厚成阶段为扁圆形。养殖的海带成藻一般长2m～4m，宽20cm~40cm。野生的海带成藻一般长0.8m~1.8m，宽8cm~20cm。有两条浅的纵沟贯穿叶片的中部形成较厚的中带部，叶片边缘薄而软，有波褶。1
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3.2孢子体内部构造特征
柄和叶片均分三层组织，外层为表皮，其内为皮层，中央为髓部。3.2.1表皮
由一层个体小、排列紧密和整齐的细胞组成，呈栅栏状。细胞含粒状色素体。3.2.2皮层
外皮层细胞呈柱状，大小不等，排列不整齐。内皮层细胞大小相近，排列较整齐。3.2.3髓部
由喇叭丝和髓丝组成。
4生活周期与繁殖
4.1生活史
明显的孢子体(2n）与配子体(n)不等世代交替型。4.2生命周期
海底自然繁生的海带，其寿命为两年。4.3繁殖
4.3.1性成熟年龄
10个月～12个月。
4.3.2无性繁殖
孢子体产生单室孢子囊群，每个孢子囊内形成32个游孢子。游孢子单细胞，梨形，长6.9um～8.2μm，宽4.1um~5.5μm，有两条侧生不等长鞭毛，前面一条长17.8um~19.6um，后面一条长6.9μm~8.2μm。
4.3.3有性繁殖
卵配方式。雄配子体产生精子囊，每个精子囊产生一个梨形精子。精子长4.4μm～6.2μm，宽2.7m~3.4μm，具两条侧生不等长鞭毛，前面一条长13.7μm~16μm，后面一条长16μm~19μm。精子（n）与附着在卵囊口处的卵（n）结合生成合子（2n）。5遗传学特征
5.1染色体数
孢子体细胞染色体数2n=44。
5.2DNA序列特征
5.2.1ITS-1序列：总长度238bp。1CCGAAAGCGG GTTCGTTCAATCCCCCCCGCTCTATAAATT GTCTGTGAGG CCGCTTCGTG61CGGCCTCTTTACCCCGAGAAAGAATTCGTT ATGCGAAGTT GGGCGAGGGG CGCCTCGCCG121AGAGCCTGTGAAAAGGCCCT CGAATCAAAGCGCACCCCACATTTCAACCCATTAAACTCT181GAATCTGAACTCAAAGGGGC GCTGCGCTAGCCGCGGCTCCCCCAACCTTTAACGTTGT5.2.2ITS-2序列：总长度258bp。1GACACCACTCGCCCCTCTTCTCTCCTGTCTCACGACGGGGGAGTCGCGGC GGCGGACTTT61GAGTGTTCCG GAGTTCCCAT GCTCCGAGTG CACCTAATCTCGTGAACGAA GCCTCTCGCG121CCCTGCCGCA
CAGAGTTGTTGACGGCGCTCGCTTCGGCGGCGACTCTCGACTCACCAAAC181GTGCGCAGGATGCCTGCCTCATTCCGGCGCTCCGACGCCGACCCTTCTGGGTCAGCGTCG241GAAACCGTACCACTTTCG
6检测方法
6.1形态构造检验
采用肉眼和显微镜观察相结合的方法。6.2染色体检验
6.2.1标本的制备
压片法。
6.2.2染色液
2%(质量分数)地衣红溶于70%（体积分数)的乙酸中。6.2.3染色方法
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固定材料在自来水中浸泡15min～30min后压片。揭开盖片，滴入醋酸地衣红后盖片0.5h，用滤纸吸出多余的染色液，石蜡封片。6.3海带ITS序列的检测
6.3.1海带配子体DNA的提取
取约1g(湿重）的海带配子体，加少量石英沙和PVP-40，在液氮中研成粉末。将粉末转至50mL的离心管中，加人15mL裂解缓冲液（10mmol/LTris-HCl，10mmol/LEDTA，1.0mol/LNaCl，1.0%CTAB，1%SDS，pH8.0），在65℃保温1h，期间摇勾几次。用同体积的三氯甲烷十异戊醇(24+1)抽提一次，再将水相转移至一新的50mL离心管中，加人1/3体积的4mol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA，pH8.0中，加2μLRNaseA37℃保温1h，再用三氯甲烷+异戊醇（24-+1)抽提一次，异丙醇沉淀回收DNA。DNA最后溶于一定体积的TE中，检测DNA的浓度。6.3.2ITS特异性扩增
总反应体积为20μL，含10mmol/LTris-HCl(pH8.3），50mmol/LKCl,1.5mmol/LMgClz，Taqpolymerase1U,4种dNTP各2mmol/L,两个引物各4mmol/L~6mmol/L,模板DNA10ng，其余用双蒸馏水补满。
PCR反应参数：96℃预变性5min96℃.30s，72℃、60s，55℃30s，37个循环，72℃，保温5min。6.3.3ITS序列扩增引物
正向引物：5'-AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3'。反向引物：5'-AATCCTGGTTAGTTTCTTTTCCTC-3'。6.3.4测序
参照DNA测序仪进行测序，见附录A。6.4判定规则
以第3章为主，结合第4章、第6章判断检验样品结果。经检验，符合上述质量要求的样品为合格样品。
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附录A
（规范性附录）
DNA序列的测定
A1测序样品预处理：PCR扩增完毕，将样品置于一20℃条件下。随后除去矿物油，残留的部分用等体积的三氯甲烷抽提一两次。经纯化后，获取纯化的DNA。A.2洗脱：用洗脱液[10mmol/LTris和0.1mmol/LEDTA（pH8.0)］将纯化的DNA进行洗脱，然后克隆到pT7BlueT-vector中，PCR产物和载体的摩尔比为5：1，所用的酶为高活性的T4连接酶，接着进行细菌转化。
A3从含有合适插人片段的克隆中分离出质粒DNA。A.4用质粒纯化试剂盒从细菌克隆中提取和纯化DNA。A.5纯化后的DNA在DNA测序仪上采用Sanger双脱氧链终止法原理在两端同时进行测序。具体如下：
设立双脱氧测序反应：
引物，测序引物即为扩增引物。a）
微量滴定板，为96孔U形微量滴定板。b）
链延伸一链终止反应混合液的配置。c
A.5.2准备样品和列表，上样到微量滴定板中进行测序。A.6测序条件：电压160V/cm，温度42℃。A.7根据凝胶的荧光放射自显影，运用计算机读取DNA编码。A8打印测试结果，然后进行数据处理。版权专有侵权必究
书号：155066·1-28577
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