【商检行业标准(SN)】 牛病毒性腹泻/粘膜病检疫规范

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1129—2007
代替SN/T1129.1~1129.2—2002
牛病毒性腹泻/粘膜病检疫规范
Quarantine protocol for bovine viral diarrhea/mucosal disease2007-08-06发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2008-03-01实施
SN/T1129—2007
本标准代替SN/T1129.1一2002《牛病毒性腹泻/粘膜病病毒微量血清中和试验操作规程》和SN/T1129.2—2002《牛病毒性腹泻/粘膜病病毒分离操作规程》。本标准的附录A和附录B均为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境检验检疫局。本标准主要起草人：孙颖杰、张伯强、白泉阳、张体银、袁文泽、简中友、董志珍、霍蕾。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T1129.1—2002;
SN/T1129.22002。
1范围
牛病毒性腹泻/粘膜病检疫规范
本标准规定了牛病毒性腹泻检疫规范SN/T 1129—2007
本标准适用于牛病毒性腹泻的病毒分离鉴定、病毒抗原检测、病毒抗体检测，可用于该病的检疫、诊断和流行病学调查。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3疾病概述
牛病毒性腹泻（bovineviraldiarrhea，BVD）是由牛病毒性腹泻病毒（bovineviraldiarrheavirusBVDV)引起的一种以腹泻为临床特征的传染病，可导致怀孕母牛的流产、死胎、致畸或新生特牛的持续感染，它具有高度传染性，但症状和病变较轻，发病率高而死亡率低。粘膜病（MucosalDisease，MD）也是由BVDV引起的一种以牛的急性型口腔、消化道粘膜发炎、糜烂、溃疡为特征的传染病。它和牛病毒性腹泻是同一病原引起·但表现不同的临床症状，发病动物口腔，特别是沿齿龈边沿糜烂，还可出现流泪和大量流涎。该病传染性不高,临床症状明显，发病率低，而死亡率很高。其病原、流行病学、症状、发病机理和病理变化、检疫及诊断参见附录A。4检疫方法
4.1病毒分离和鉴定
4.1.1仪器试剂
4.1.1.1倒置荧光显微镜
二氧化碳培养箱
4.1.1.310mL标准细胞培养瓶，24孔平底细胞培养板，带盖湿盒4.1.1.4无BVD抗体胎牛血清，细胞分散液。BVD标准毒株（OregonC或NADL)和标准阳性血清，BVD荧光抗体，BVD酶标抗体。4. 1.1.5
4.1.1.6细胞：使用MDBK细胞或三代以内未感染BVD病毒的胎牛肾细胞（BK)。溶液及细胞培养液：配制参见附录B4.1.1.7
4.1.2样品的采集
4.1.2.1对于牛群、种牛的检疫，应无菌采集血液或者精液。4.1.2.2对于怀疑为死于病毒性腹泻的牛，应采集血凝块和肠系膜淋巴结。4.1.2.3对于流产、死胎牛的检疫，应采集胎儿的组织。4.1.3样品的处理
4.1.3.1血液用常规方法分离血清，血凝块应冻融3次后，取析出的上清液4.1.3.2精液冻融3次（或超声波裂解后，按规定稀释.离心取上清液4.1.3.3
动物组织加10倍体积含有10001U/mL双抗的细胞培养液研磨，离心取上清液1
SN/T1129—2007
4.1.4样品的培养
4.1.4.1取生长良好，形成80%以上单层的MDBK细胞，倒去培养液，接种处理好的样品，每瓶接种1mL，每个样品接种3个细胞瓶，同时直接接种样品稀释液作为阴性对照。4.1.4.2置37℃二氧化碳培养箱吸附30min~60min4.1.4.3倒去样品，加入维持液，37C二氧化碳培养箱培养6d。4.1.4.4收获病毒，同一样品3瓶混合，放至一20℃冻融3次后进行下一步鉴定4.1.5荧光抗体法鉴定
4.1.5.1将生长良好的细胞，用细胞分散液处理后，制备成2X10°个/mL的细胞悬液，加人24孔细胞培养板内，每孔0.8mL，置37℃培养4.1.5.2待细胞生长成80%的单层，吸出孔内培养液，接种样品培养物，每孔400uL，每个样品4个孔。阴性、阳性和空白细胞对照方法同待检样品培养物。4.1.5.3置37℃二氧化碳培养箱吸附30min~60min4.1.5.4吸出各孔内所加的待检和对照样品，加入维持液，每孔0.8mL，置37℃二氧化碳培养箱培养3d。
4.1.5.5弃掉24孔培养板内的培养液，用磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗自然干燥后，用一20C丙酮固定15min，用PBS洗3次，自然干燥。4.1.5.6取固定好的24孔培养板，每个待检样品及阴性、阳性和空白细胞对照孔分别加入BVD阳性血清各2孔，每孔400μL，置37℃作用1h。4.1.5.7弃掉板孔内的BVD阳性血清，在所有板孔内加人工作浓度的BVD荧光抗体400μL,放进湿盒，37℃作用2h。
4.1.5.8用PBS洗3次，倾去液体，自然干燥。4.1.5.9镜检。
4.1.5.10结果判定
阳性对照在显微镜下胞浆呈黄绿色，并见有黄绿色荧光的细小颗粒散布于胞浆内；阴性对照、空白对照无荧光。
如果没有经过阳性抗体作用的细胞孔荧光较亮，形态清晰，而经过阳性抗体抑制的同一样品无荧光，则判为阳性。
如果没有经过阳性抗体作用的细胞孔荧光微弱，形态不清晰，经过阳性抗体抑制的同一样品无荧光，为可疑，需重检。重检后细胞孔仍然荧光微弱，形态不清晰，则判为阳性，重检后无荧光则判为阴性。如果阳性对照无特异性荧光，则试验失败，应重新检测。4.1.6免疫过氧化物酶单层法（IPMA）鉴定4.1.6.1取4.1.5.6固定的24孔板，弃掉板孔内的BVD阳性血清，在所有板孔内加入工作浓度的BVD酶标抗体400μL，放进湿盒，37℃作用1h。4.1.6.2弃去板中液体，用洗液洗板3次，每次1min~3min，最后在吸水纸上轻轻拍干。4.1.6.3每孔加人显色/底物溶液400μL，封板于室温（18℃～24℃）下感作30min4.1.6.4奔去板中液体，洗涤1次，方法同4.1.6.2，再用三蒸水洗涤2次，最后在吸水纸上轻轻拍干，待检。
4.1.6.5结果判定与解释
将24孔板置于倒置显微镜判读。阳性对照在显微镜下细胞浆（可能仅见于部分细胞）出现弥漫状或团块状棕红色着染，阴性对照、空白对照无棕红色着染。如果没有经过阳性抗体作用的细胞孔出现棕红色着染，而经过阳性抗体抑制的同一样品无棕红色着染，则判为阳性。
如果对照不成立，则试验失败，重新检测。2
4.2微量血清中和试验
4.2.1仪器试剂
4.2.1.1溶液及细胞培养液：参见附录B4.2.1.2BVD标准毒株（OregonC2或NADL）和标准阳性、阴性血清4.2.1.3细胞：使用MDBK细胞或三代以内未感染BVD病毒的胎牛肾细胞(BK)。SN/T1129—2007
4.2.1.4被检血清：无菌自牛静脉采血，分离血清编号后备用。本方法使用的阳性血清、阴性血清和被检血清应经过56℃、30min灭活处理4.2.1.5无BVD抗体胎牛血清，细胞分散液。4.2.1.650mL标准细胞培养瓶，96孔无菌细胞培养板，50uL、100L微量可调移液器。4.2.1.7倒置光学显微镜
4.2.1.8二氧化碳培养箱
4.2.2种毒的制备
将BVD标准毒用维持液作10倍稀释，取长成良好单层的细胞，用PBS洗1次后，按培养液十分之一的量接种病毒，置37C作用30min，加入维持液，37℃二氧化碳培养箱培养至80%细胞出现病变，收获病毒，放至一20C冻融3次或者超声波（60W）裂解8个循环，每次15s，冰浴45s，3000r/min离心10min，取上清液，分装小瓶，置一70℃保存备用。4.2.3病毒的毒力测定
将制备的标准病毒抗原，用维持液作10倍递增稀释至10-，每个滴度接种细胞培养板8个孔，每孔50μuL.随后每孔加人细胞悬液（3×10°/mL）100μL和细胞维持液50μL。同时每板设8孔细胞对照。置37C二氧化碳培养箱，逐日观察至6d，记录细胞病变，按Reed-muench或Karber方法计算细胞半数感染量（TCIDs/50μL）。
4.2.4操作程序
4.2.4.1阴性血清对照：每孔加阴性血清50uL、100TCIDs的病毒悬液50μL，设4孔。4.2.4.2阳性血清对照：每孔加阳性血清50μL、100TCIDs的病毒悬液50μL，设4孔，4.2.4.3被检样品：在定量试验中，先将被检血清用维持液作1：2、1：4连续借比稀释至2-*后加到96孔板中，每一稀释度4孔，每孔50μL，然后每孔再加100TCID/50μL的病毒悬液50μL。在定性试验中，将被检血清增加一个稀释度即1：5稀释，其他步骤与定量方法相同4.2.4.4被检样品毒性对照：每孔加被检血清原样100μL，设4孔。4.2.4.5细胞对照：每孔加100L维持液，设4孔。4.2.4.6病毒回归对照：将BVD病毒稀释成100、10、1、0.1TCID，每个稀释度4孔，每孔加病毒悬液50μL，维持液50μL。
4.2.4.7以上对照和被检样品置37℃温箱中作用1h后，每孔加人3×10°个/mL细胞悬液100μL，置37℃二氧化碳培养箱培养。
4.2.5结果判定
在37℃二氧化碳培养箱培养第4天开始观察结果，连续观察3天判定结果。当病毒用量在30TCIDso/50uL～300TCIDs/50uL范围内，阴性血清对照出现典型细胞病变，阳性血清对照无细胞病变，被检血清对细胞无毒性，细胞对照正常，证明试验成立，可以进行结果判定，否则，试验不成立，予以重做。
4.2.6判定标准
在定量试验中，按Reed-muench或Karber方法计算半数保护量（PD5），即为该血清的中和效价在定性试验中，被检血清在1：5稀释度时有两个或两个以上孔的细胞完全被保护，该血清即为SN/T1129—2007
阳性。
4.3抗原捕获酶联免疫吸附试验
4.3.1试验材料
牛病毒性腹泻/粘膜病抗原捕获ELISA诊断试剂盒2℃～8℃保存。试剂盒内应包括的物品如下：牛病毒性腹泻-粘膜病病毒多克隆抗体包被板；抗BVDV单克隆检测抗体；BVDV阳性对照血清；BVDV阴性对照血清；辣根过氧化物酶（HRP)标记的牛抗鼠抗体；10X样品稀释液；10X浓缩洗液；TMB底物溶液；终止液。
4.3.2样品的准备
4.3.2.1组织样品
使用尽可能新鲜的组织样品，组织可在2℃～8℃保存一个月或长期冷冻保存，样品最好为扁桃体、牌脏、小肠及肺脏，用剪刀将1g~2g样品剪碎（2mm~5mm），将剪碎的样品置于10mL离心管中，加人5mL样品稀释液（1×），混匀，室温感作1h2h，1500r/min离心10min，上清液作为检测样品备用。
4.3.2.2外周血液白细胞
将肝素或EDTA抗凝血样10mL2000r/min离心15min~20min。用1000μL移液器吸取沉淀表层的淡黄色液体，重悬于500μL样品稀释液中，每个样品换一个吸头。置室温1h，期间涡旋振荡数次，2500r/min离心5min，上清液作为检测样品备用。如果样品的压缩细胞体积非常小，则用所有的血细胞来操作（包括红细胞），将细胞转移到10mL离心管中，并加入等体积2C～8C预冷的0.17mol/L的氯化铵（NH,Cl)溶液，置室温10min。加入2C8C预冷的超纯水（或双蒸水）适量，轻轻翻转摇匀，2500r/min离心5min。弃去上清液，加人500μL样品稀释液（1×）到血细胞中，每个样品使用新的吸头，涡动混匀，置室温1h，期间涡旋振荡数次。2500r/min离心5min，上清液作为检测样品备用。
4.3.2.3鼻拭子
将拭子放人底部有小孔的微型离心管中（可用热针头打空），并将微型离心管放入另一个Eppendorf管中，2500r/min离心5min。弃去底部有小孔的微型管，并在Eppendorf管中加人与获得样品等体积的样品稀释液（1×），混匀，室温下放置1h～2h，期间振荡数次。2500r/min离心5min，上清液作为检测样品备用。
4.3.2.4细胞培养物
将细胞培养物3000r/min离心5min，弃去上清液；加入500μL样品稀释液，轻轻振荡混匀，置于室温1h，作为检测样品备用。
4.3.3仪器与设备
酶标仪（波长450nm或双波长450nm/620nm），振荡器，高速台式离心机，冰箱，温箱，8道或12道洗头洗板机，8道或12道移液器（50μL~300μL），8单道移液器（0.5~10μ；40μ~200μL；200μL~1000μL和2mL~10mL)，吸头（10μL，200μL；1000μL),Eppendorf管。4.3.4试剂准备
试剂盒各组分在使用前恢复至室温（20℃～25℃C）；0.17mol/LNH.Cl溶液（提取白细胞用）；洗涤液：用蒸馏水将浓缩洗液稀释10倍（1：10），混匀备用。稀释用蒸馏水应符合GB/T6682的要求。4.3.5操作程序
4.3.5.1加抗BVDV单克隆检测抗体：用8道或者12道移液器在酶标板每孔中加人50μL抗BVDV单克隆检测抗体（试剂盒提供）。4.3.5.2对照：加50μL阴性对照血清至酶标板的A1、B1孔；加50μL阳性对照血清至A2、B2孔。4.3.5.3加样：在酶标板的其他相应孔中各加人50μL已稀释好的被检样品。4.3.5.4感作：将酶标板封板后，在振荡器上混合1min后.置2℃～8℃下过夜感作14h～18h或4
37℃下感作3h
SN/T1129—2007
4.3.5.5洗涤：弃掉各孔液体，每孔加入250uL～300uL已稀释好的洗涤液，轻轻振动后甩掉，连续洗涤5次。最后一次洗涤后，将酶标板在吸水纸上轻拍，除去孔内剩余的液体。4.3.5.6加酶标结合物：每孔加入100L辣根过氧化物酶（HRP)标记的牛抗鼠抗体。4.3.5.7
感作和洗涤：将酶标板封膜后，置室温下，感作30min。重复4.3.5.5洗涤。4.3.5.8加底物：每孔加人100LTMB底物溶液。感作：将酶标板置20℃～25C下黑暗处感作10min，从加完第一孔开始计时。4.3.5.9
4.3.5.10加终止液：每孔加100uL终止液，终止颜色反应。测定吸光值（OD）：酶标仪以空气作为空白对照，于15min内，在450nm波长下测量和记录4.3.5.11
样品和对照的OD值。
4.3.6试验有效性检测
只有在阳性对照孔所得的平均值减去阴性对照孔所得的平均值大于0.15，且阴性对照孔所得的平均值小于0.2时，测定结果才有效。4.3.7结果计算和判定
4.3.7.1结果计算
按式（1）、式（2)和式（3)计算结果：NCX=(ODA1+ODB)/2
式中：
式中：
式中：
阴性对照血清孔OD值的平均值；A1孔阴性对照血清的OD值；
B1孔阴性对照血清的OD值。
PCX=（OD2+OD)/2
阳性对照血清孔OD值的平均值；A2孔阳性对照血清的OD值；
B2孔阳性对照血清的OD值
S/P=(ODsNCX)/(PCX-NCX)
被检血清OD值与标准阳性血清OD值的比值：样品孔的OD值；
阳性对照血清孔OD值的平均值；阴性对照血清孔OD值的平均值。4.3.7.2结果判定
（1）
如果S/P值小于0.20.样品判为牛病毒性腹泻/粘膜病阴性：如果S/P值介于0.20和0.30之间，样品判为牛病毒性腹泻/粘膜病可疑应重新检测；如果S/P值大于等于0.30，样品判为牛病毒性腹泻/粘膜病阳性、
SN/T1129—2007
附录A
（资料性附录）
疾病概述
A.1牛病毒性腹泻/粘膜病（bovineviraldiarrhea/mucosaldisease，BVD/MD）牛病毒性腹泻/粘膜病是由牛病毒性腹泻病毒（bovineviraldiarrheavirus，BVDV)引起的一种以粘膜发炎、糜烂、坏死和腹泻为特征的传染病。A.2病原
BVDV属于黄病毒科（Plavirdae）瘟病毒属（Pestivirus），有囊膜的单股正链RNA病毒，核衣壳为非螺旋的20面体对称结构，直径约40nm；病毒基因组长度药为12.5kb，含有一个大的开放阅读框（ORF）,可被靶细胞核糖体转译成一个近4000个氨基酸残基的前体蛋白，进一步由病毒和细胞肽酶加工产生至少9种蛋白多肽。基因顺序为5-P20-P14-gP48-gP25-gP53-Cp54/P80-P10-P30-P133（P58/P75）-3。其中核衣壳蛋白P14（C)和糖蛋白gP48（Erns）、gP25（E1）、gP53（E2）为病毒结构蛋白。本病毒对乙醚、三氯甲烷、胰酶等敏感·pH3以下易被破坏，50℃C氯化镁中不稳定，56℃C很快被灭活；血液和组织中的病毒冻干可存活多年，能在胎牛肾、罩丸、肺、胎羊罩丸、猪肾等细胞培养物中生长，也适应于牛胎肾传代细胞系。根据BVDV在细胞培养中是否产生病变可将BVDV分为两种生物型，产生细胞病变即致细胞病变型(CP),不产生病变的即非致细胞病变型（NCP)。A.3流行病学
本病呈地方性流行，全年均可发病，多发生于冬季和初春。该病自然感染的宿主主要是黄牛和乳牛，其次为耗牛、水牛、山羊、绵羊、猪及骆驼和鹿等多种动物，对各种年龄的牛均易感，尤以6月龄～18月龄的特牛发病率较高。本病可通过直接接触或间接接触而传染，还可通过胎盘感染，特别是妊娠后120天内感染，病毒可穿过胎盘而感染胎儿，应特别注意通过带毒的精液而传染。妊娠50天～150天牛感染BVDV，此时胎儿免疫系统尚未建立引起免疫耐受，出生后即成持续感染牛，这些牛死亡率很高，幸存牛可带毒200余天，不断通过异液、睡液、精液、尿液、眼泪和乳汁向外界排毒，是BVD主要的传染源。山羊、绵羊、猪、鹿及小袋鼠等都可感染，虽然没有明显临床症状，但可产生抗体，也是本病的传染源。该病呈世界性分布，特别是畜牧业发达的国家更为严重。A.4症状
本病潜伏期7天～14天。在临床上分为急性、慢性经过。急性病牛主要表现为突然发病，体温升高，重度腹泻，白细胞减少，大量流涎，口腔粘膜糜烂和溃疡，可在发病后几天死亡。病母牛所产的特牛发生下痢，在口腔、皮肤、肺和脑有坏死灶，在体温升高的同时白细胞减少。慢性病例临床症状不明显或逐渐发病，生长发育受阻，消瘦，体重逐渐下降。比较特殊的症状是点镜上的糜烂，糜烂可在鼻镜上连成一片，表现为间歇性腹泻，有时因蹄叶炎导致跛行，病程较长，可在发病几周或数月死亡。
A.5发病机理和病理变化bZxz.net
持续性感染是BVD发病的重要环节，也是BVDV在自然环境中维持存在的一种形式。它是由于妊娠母畜在怀孕早期通过子宫内感染NCPBVDV引起。此时胎儿的免疫系统尚未发育成熟，不能识别外来的NCPBVDV，这种胎儿出生后一且存活即成为持续感染牛，其临床表现正常，血清学阴性，即6
处于免疫耐受状态，持久带毒、排毒。SN/T1129—2007
研究证实.CP和NCP型BVDV在致死性MD的致病机理中都起着重要的作用。发生MD的前提条件是怀孕母牛在妊娠早期感染NCPBVDV，其结果生产出持续感染特牛，这种持续感染犊牛对相应的NCPBVDV表现免疫耐受。持续感染动物当再次感染抗原性相似或同源的CP型病毒时就会发生MD，而异源病毒能够被机体识别且不被免疫系统所耐受，这也正可以解释某些持续性感染的动物体内存在BVDV抗体的原因。
本病的主要病理变化是消化道粘膜充血、出血、水肿和糜烂。特征性损害是食道粘膜有大小不等的形态与直线排列的糜烂，胃粘膜水肿和糜烂。A.6检疫及诊断
根据消化系统充血、出血、水肿、糜烂和溃疡，呼吸道充血，鼻孔出血，唇和口腔粘膜有烂斑，肠系膜淋巴结以及集合淋巴滤泡肿大坏死，冠状沟和心内膜有出血斑等，可以做出初步诊断，进一步确诊应依靠实验室检查。目前已建立和应用的实验室诊断技术有病毒的分离与鉴定、免疫荧光试验、免疫过氧化物酶单层试验（IPMA)、抗原捕获酶联免疫吸附试验和血清中和试验（SN)等SN/T1129—2007
B.1培养液
附录B
（资料性附录）
溶液配制
MEM培养基.加人10%无BVD病毒抗体胎牛血清（56℃，30min灭活）含青霉素200IU/mL，链霉素200IU/mL，抽滤除菌，置4℃保存备用。B.2维持液
MEM培养基，加人2%无BVD病毒抗体胎牛血清（56℃，30min灭活），含青霉素200IU/mL，链霉素200IU/mL.抽滤除菌，置4℃保存备用。B.3
细胞分散液
乙二胺四乙酸二钠
无钙镁离子PBS
混匀抽滤除菌，置4℃保存备用
B.4无钙镁PBS
氯化钠
氯化钾
磷酸氢二钠
磷酸二氢钾
一级水
1000mL
1000mL
将上述成分依次溶解、混匀、分装、高压灭菌（68.94kPa.15min）。5磷酸盐缓冲液（PBS.0.01mol/L、pH7.4）B.5
氯化钠
氯化钾
十二水磷酸氢二钠
磷酸二氢钾
一级水
1000mL
将上述成分依次溶解、混匀、分装、高压灭菌（68.94kPa，15min）。B.6
包被缓冲液碳酸盐缓冲液（CBS）.0.05mol/L、pH9.6碳酸钠
碳酸氢钠
氯化钠
加去离子水至1000mL。
B.7洗液（含0.05%Tween-20的0.01mol/L、pH7.4的PBS,即PBST)Tween-20
加0.01mol/L、pH7.4的PBS至1000mL。3底物缓冲液（磷酸氢二钠-柠檬酸，pH5.4）B.8
0.2mol/L十二水磷酸氢二钠
0.1mol/L柠檬酸
去离子水
SN/T1129—2007
使用前称40mg邻苯二胺（OPD）溶解在上述溶液中，完全溶解后再加150uL3%过氧化氢（H2O2），混合后立即使用
9终止液[2mol/L硫酸（H,SO,）
浓硫酸
去离子水
SN/T 1129-2007
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
牛病毒性腹泻/粘膜病检疫规范
SN/T1129—2007
中国标准出版社出版
北京复兴门外三里河北街16号
邮政编码：100045
网址spc.net.cn
电话：6852394668517548
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*
开本880×12301/16印张1字数17千字2007年11月第一版，2007年11月第一次印刷印数1—2000
书号：155066·2-18214
定价10.00元
0—6 /
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。