【商检行业标准(SN)】 马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1135.5—2007
马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法
Identification of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus2007-12-24发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2008-07-01实施
SN/1 1155 ≠分为五 个部分:
马铃芎病肝病检鉴定方法；
马铃莺黄化矮缩病毒检疫鉴定方法；一马饸薯顶病毒疫鉴定方法；
一马饸薯黑粉病菌捡疫竖定左法；铃英怀腐蔽菌检疫鉴定方法，
本部分是SN/TI!的第部分
本部分闪除录、附录均为规范性附录.附录A为资料性附录。本部分山国家认证认可监肾管理委员会提出并们口。S>/T1135.5—2007
本部分起草单位中国检验捡疫科学在究院十华人民共和国北京出人培检验检疫局。本部分王要起章人：赵义军、陈红遂、梁新肯、张乐、米水芳、魏梅生本部分系首次发市的出人境检验检疫行业标准T
1范围
马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法
SN门1I!的本部分规定了卫铃离坏腐病因的检鉴定方法本部分适用」臣有进出境乃铃葬种葬及商品用英的检疫和定。2术语和定义
下列术语和定义挂用于SN/T 11污的本部分。2.1
双抗体夹心酶联免疫吸附测定
S>/T1135.5—2007
在固H支持物上（酶联板)包被纠菌特异性抗体，加入待测伴的后、士用酶标记的纠菌抗体进行免积别：最后迪过酶诞化学反成检测纵萄是否存在的一种而清学检测方法2.2
以耐热TNA聚合酶和一刘引倒(与待测H标核酸分了字列同源的DXA片段)通过高温([>A分了变性)利低温(引物利H标核酸分了复性并被耐热INA聚合嗨延伸)交替循环扩增待测H标核酸分子的方法：
3原理
马铃萼环璃病萄（Ctuwtuzternichigensiszulbesepertomicus）属原壁萄门Finmctles)厚空细菌纲（Firiilaclerie）棒形计菊属（Citxcier），依掌病尊进行远所离传播：奇1:及世界分布参见附录A4仪器和用具
4.1仪器设备
PCR仪、招净工作、灭菌锅,制冰孩酸蛋白分仪,高速冷冻离心机、台式小型离心机，招低温冰箱、营规冰箱.避涡振荡器.微量进样，电浓仪、凝胶成像系统，酶标仪。4.2主要试剂
除另有规是外，所有微剂均为分新纯：PCR缓冲液、象化线（MCl）dVTP（dATPdTTPdCTP,lGTP）、Taq D>A聚合姆、引物和探针、牛肉汁、酵母膏、磷酸氢一钾（K.III'O,）、磷酸一氨钾(KII.PO）、硫酸镁（MgSO.）)、葡萄精、球脂，酶联检测试剂见附录B5病菌的鉴定
5.1症状检查
夜详品量1苦样品少可适量增大比例)的决茎进行检将块鉴横访·检杏怀腐病因慢染症状·挤压埃壶，检产维管纠到是否浸解，发病轻节维管束变页，品不连续的点状变：不节整个维管束坏变色，病菌山可侵古琪壶维管束厌国的薄壁纽织，品环法烃·严时可弓引起皮层与髓部纽织分离、轻轻脐压头茎从维管束中滞出奶酪样的柱状物：块茎表面的症状在轻度危古叫不明显，随痣古发展，皮色变培变祸.严重时丧皮叫出现裂缝。5.2双抗体夹心酶联免疫吸附测定利用双抗体类心酶联免疫吸附测定法对样品逆行划解（见陆录上)：若检测结果为门性：需过行病原$N/T 1135.5—2007
菌的分离培养及5.1方法测定：
5.3病原菌的分离培养
5.3.1培养基的制备
营养肉汤酵母旁培养基（NBY）：牛肉8.0：世旁2.08：磷酸氢二铆（KHP0.)2.0X磷酸二氢铆(KHP(,)0. E乌-葡萄糖 2. 5 %-琼脂 15. g:水 1 L:灭菌片加 1 mL 过滤灭菌的 1 mol/L 巯酸镁(MgSO溶液：
5.3.2块茎中病原菌的分离培养
蛋铃荠块茎洗净后用乙醇表面消毒mil以带病荠庆的维管束挑取少量菌脓在N[3Y培养率上划线从带病攻坚的维管束圈划琅少量病纤织.在灭菌水中捣碎制成悬浮液.而接苗怀蕴菌悬液划线，经两次纯化培养后转人培养基斜面5.4PCR凝胶电泳检测
见附录（
6结果判定
芒酶联免疫检测结果为门性,可初步判定为检出马铃落坏腐病菌-需利用5.1方法进一步检测。在5.1检测中ICR凝胶电泳捡测结乐为阳性而且扩增片殷人小与描述杠符可判定为马铃著斑腐病菌
7样品保存与复核
7.1样品保存与处理
样品经登记和丝手人签后要善保存。对恰出马铃环离病菌的样品寇保存于1℃冰中，以爷复核，滋类样品保存期满店虚经产压菊后方可处理。7.2菌株保存与处理
原检测样品中分离并鉴定为马铃薯坏腐病菌的菌殊；成要苦保存，将菌探接种于B暗养基刹面上：28培养481：然后4（.冰箱架或液体音养至对数牛长期：加人2C乐灭菌H油并泥勾，一80℃长期保存或门安瓶管冷冻干燥长期保在，刘不需要长期保存的国栋应及高注灾菌处理。7.3结果记录与资料保存
完宪整的实验记录位括:样品的浆源、种类时间：实验的时司、托点，方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签孚。酶联免疫方法需有酶联反成的原始数据,PCR凝校电检测需有电泳结景照片7.4复核
土国家质量监肾检验险疫总局指定的单位或人员负贞，要考案实验也录、照片等资料的完整性和京实性·必要时迹行复该实验。A.1寄主范围
附录A
（资料性附录)
寄主及世界分布
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自然密士只有马铃（Solanun iuberorum）接种省于有薪（Lycopersicun usculenium），芹(Selanin inelengera等
4.2分布地区
阿富汗、凡本、康埔寨、朝鲜、黎巴嫩、尼泊东、土环点、中国、中国台湾、巴毕斯、墟南、俄罗斯、捷克、斯洛伐忙、丹差、芬、挪威、波“、瑞典、加拿大、美国、哥达黎川、拿马、秘言委内瑞拉、德国、希略、前南拉大、事帮牙，奥批机、即伦此业法国，器西可、罗更尼业比利的时。时录
（规范性附录）
双抗体夹心酶联免疫吸附测定
B.1试材
B.1.1酶联板的要求
使用质量有保证厂角牛产的酶联饭，B.1.2包被抗体
特异性的马铃弯环腐病菌抗体
B.1.3酶标抗体
碱性磷酸酷酶长记的马铃薯孙腐病葡抗体B.1.4底物溶液
对硝基本磷酸一钠（ePT\)100)1r1溶解于底物缓冲液1(0m11.中,现现：B.1.5样品抽提缓冲液
溶 PST:
业硫骏钠（NA:SO）
PVP(MW2A C00--10 0C0)
氨化钢（VaN：）
吐滑 20 ((wee 20)
调 \H伯允7.1.4<冰箱保存。
B.1.6包被缓冲液
碳酸钠(Na
碳酸氨钠（NaHC（)）
氮化钠（NaN
溶于蒸馏水,调H 值牟 9.S.蒸馏水定容牟」0 ml..1冰箱保存B.1.7IBST缓冲液（洗涤缓冲液）浴十1L蒸馏水
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氯化(NC
磷酸氨一例NHPU,
磷酸一氢钾iKH.P(,)
氧化钾(KCI）
叶温 2u(Twccn 2t)
调pH值至7.4，4冰箱保存。
B.1.8酶标抗体稀释缓冲液
溶于 1 1/ PI3ST:
3SA(兰血清白蛋白)或脱脂奶粉
PVP(MW24 C0-~40 3C0)
叠氮化钠（NaN，）
调 βH值至7,4,4冰箱存。
B.1.9底物(pNPP)缓冲液
溶干&tmil.蒸馏水：bzxZ.net
氯化镁（Mgtl）
登氮化钠(NaN：）
三乙驿胺
用pH调至.S.燕留水定容至「I.+冰箱深存，B.2程序
B.2.1包被抗体
用包被缓冲液将抗体按说明稀释：加人酶联板中：1C0/孔：加盖.37孵育2l.猎孔中溶液，FEST洗涤次，科次3rin.
H.2.2样品制备
待测样品接「：I重量体积.WV)加人证提缓冲液用码体研落成浆,20)离心Icmi，上消即为制备好的检测样品：对于块壶可以在而有适量由提缓冲液的原料袭中拍弱，最「清液：对店性对照、刊性对照作的处理或安照说阴进行。B.2.3加样
加制备好的捡测样品阴性对照，阳性对照10孔加益.37方h或1冰箱孵方过夜PBST选涤4次.每次3min，每个样重复2次B.2.4加酶标抗体
根据说明书而嗨你抗体稀释缓汁液将嗨长抗体烯释牟工忙浓度·人到酶联板中的叫孔·加盖37孵育2h，PBST洗涤1次，每次3minB.2.5加底物
将底物NPP 圳人到底物缓冲液中，繁液度为「mg/ml现现用）按孔入μl.,率温避光睡骨 3 mi
B.2.6读数
30 mir店匝梅标议在105 nm处涛()值B.3结果判断
B.3.1对照孔的（1估（缓冲液孔,阴性对烂及配性对照孔）应该在质量控制范用内、即：缓冲液孔和阴性对孔的（.伯均小于.15，当阴性对照孔的（)伯小于0.0时，安51
笋;[性对摄(I)ss伯阴性对照I)o:伯太十5~-1C 重复性B. 3. 2 在满见 『 . 3. 1 质量要求后:果作如下判断:样品（/阴性对照（估明六」2,判为阳性：S>/T1135.5—2007
样品（)估阴性对照（))：：估在阔估附近：判为可疑烊品，需重新做一次：或用其他方法加以骏证：
样品（rs伯/阻性对照（明品小十2.判为阴性，若采用商品化试剂盒·按照试剂盒说明操性并判定结果附录C
（规范性附录）
PCR凝胶电泳检测
C.1病原细菌I>A的提取
C.1.1将供诚菌栋在斜面培养基上28T培准48h。C1. 2-试管中加0. 11Il/L麟酸钠缓冲液5洗菌普。C.1.3将细菌悬浮液转移牟一干净的 nl.离心笋山.l o窝心lu min齐上清液,剂人缓冲液5ml1%ss溶波30.2 mg/ml. 蛋凹嗨K 3l..混匀,37水浴孵育1h。.1.4川入等休积的三氛甲烷异戊醇（24：1)混约.120g离心1min.取上消液。C.1.5刃入体积三氯甲烷/异醇（21：1)混勺，12000g离心1CmmC.1.6将上清液移牟一新管-加人0.5倍体积的异丙醇混.12以0离心1ri1.齐上洁液：7关Z洗涤沉淀，室温十燥片;将DNA溶解在130L灭菌双蒸水中。注;病原芮NA 提改也可当赔:自接用培养的株稀释悬浊波作为模板述行 FCR这应。C.2引物序列
正间引物:5 AAGATCAGAAGCGACCCGCC 3.反间引物: TCGCACAGCCAAATCCAGC 3C. 3 PCK 反应体系及参数
C.3. 1PCR反应体系
PCR反应体系
刻名称
lOXPCR反应缓决液
氯化镁rMgCl
正间引物
反引物
TaG A整合
DVA膜饭
外H: 常
2. 5 mmol/L.
c.2 mml.l.
t. 3 μrnol/l.
c, μmol/l
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阴性对照、阳性对照和空白对照的设置所烂对照:以待测键康的马铃善Ⅱ升[>A为模板；阳性对照：采历马饸暮环病菌或含待测基因序列的质粒牛牢白对照：设两个：一是提收IVA叫设置的提收准白对照（以H代替详站）二是PCR反成的净白对照（以水代替INA模板）C.3.3PCR的反应参数：
95/3 min:95(:730 5,60/30 5.720/40 5,35 个新班。注：个司议器可根据议器耍求将反应容数作适当调蛇。C.3.4琼脂糖凝胶电泳
制备2%的凉措凝咬,接比例混匀电泳上样缓冲液和P(R扩增物:月DNA Markr：作为分子量标记·进行电泳分析，电沃结束后在凝校成像仪的紫外透射光下观察是否扩增山预期的特异烂IDNA条带·手拍援录．
C.4结果判断
通过观察：有2厉大小的产物带出现，判定为阳性6
SN/T 1135. 5-2007
中华人尺六和且出人境检验检疫行业标准
马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法
SN/T 1155. 5—2G07
困准首版社出版
北京复兴门外三里河6号
编码：10
ml: spe. nei. t.n
电话：685735168517518
中自标法出版社蒂皇虑印刷」印开 88/12301/16
张 C.7 学数 12
205午：小管版2C08年3第次印制卵效o
书号： 135036 ·2 15463
实价8.0
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