【商检行业标准(SN)】 进出口动物源性食品中地塞米松、倍他米松、氟羟泼尼松龙和双氟美松残留量测定方法 酶联免疫法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1970—2007
进出口动物源性食品中地塞米松倍他米松、氟羟泼尼松龙和双氟美松酶联免疫法
残留量测定方法
Determination of dexamethasone,betamethasone,lriameinolone and flumethasoneresidues in foodstuffs of animal origin for import and export-Enzyme-linked immunosorbent assay2007-08-06发布
中华人民北和国
到家质量监督检验检疫总局
数烈防伪
2008-03-01实施
本标难的附录A和附录B为资料性附录：本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共利国渐汇出人境检验控疫局。木标准主要起草人：张晓峰、施伟良、朱振江、吴娜、何永强，龍强。本标证系首次发布的出入境检验检疫行业标准。SN/T1970—2007
进出口动物源性食品中地塞米松，倍他米松，氣羟泼尼松龙和双氟美松残留量测定方法酶联免疫法
SN/T 1970—2007
全标准规定了动物源性食品中地寒松，倍他米松、氟羟泼尼松龙和双氟美松残留显的酶烘免疫训施方。
本标准适用于肉类纠织、水产品、牛奶和奶粉中地寒米松、倍他米松、瓶羟没尼松龙和双美松残留量的测定：
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而放为本标推的条款。乱是注明几期的引川文件，其随后所有的修改单（不包括助误的内穿）或修订版均不适月于本标准，然而，殿励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本，凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。G1/T6379测试方法的精密度通过实验室间试验确定标准测试方法的重现性和再现性GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3试样的制备和保存
3. 1 试样制备
对组织样晶品：从全部样品中坂有代表性样品，混勺，用吗分法缩分出不小丁1心0名试祥，去除脂肪、充分绞碎、混均、分装.密封,并加以标识。对牛奶和奶粉：从原始包装中取有代表性样品，充分能勾.用因分法维分出不小于500名试样.装人清洁密闭容器.加封后标明标识。3. 2 试样保存
将样品于·20%--—18℃条件下保存.4方法提要
以乙臂、俺磷酸、正已烷和二甲烷的三相液液毕取系统来提取组织中残留的地煞米松,培他米松和瓶轻设尼松龙等，处理后样品中残留的设素与硅标记地塞米松共同竟争结合地塞米松抗体同时地寒苯松抗体结合至包被有绵羊抗免gG的抗体的微孔极上，通过选涤除去木结合的残留物环酶标记地塞米松，然后加人底物显色，用酶标仪测定吸光度，吸光度值与待测物浓度战反比，根据吸光度值得出试样中残留物的含量。
5材料和试剂
除另外说明外，所有试剂均为分析纯.水为（/T6682规定的一级水。5.1地寒浆松检测试剂盒（参见附录A)。5.2偏磷酸
5.3乙脂。
5.4正己烷。
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5.5二氯甲烷。
5.60.1%确酬酸：称取1g磷酸(5.2)用水定容至1L。5.7地密米松、倍他米松、氟羟泼尼松龙和双氟美松标准品：纯度均98%。5.8地塞米松、倍他米松、氟羟泼尼松龙和双氧美松标准品落液的配制：分别用乙醇作为裕剂配制成100mg/L的储存液，干4℃~8℃条件下保存。6仪器
6.1酶标仪。
6.28道移液器:10 μL~100 μL.a6.3单道移液器：10L~100μL，20μL200l,100μL~1000μL和2ml~10ml，6.4混合振荡器。
6.5离心机。
6,6氮吹仪。
6. 7具塞试管:15 tml.
7分析步骤”
7.1提取
称取2.0g样品，置于15mL具食管中加类mL浓度为0.1%的偏磷酸（5.6)，充分混勾后加人4ml.乙脂（5.3），振荡20min+？c0am倍离心0m微取4m上清液于一干净试管，加人2mL正第混容语静置分层（装释涵，可30001/min离心5min）。吸己烷（5.1)和二氯甲烧（5.5)混金液（取1mI，中间层（乙腊和二氧甲烷混备层生资试管金味工班崖品稀释液（参见附录A）定容至O. 4 mL,即可供ELISA 检测用：鼠后稀释倍数为 1 7.2测定条件
7. 2. 1 操作条件
所有操作应在温下（20℃
(20℃～24℃:)后方可使用。
7.2.2洗板条件
7.2.2.1人T洗涤次数四次以王
7.2.2.2白动洗极可以预定四次
7.2.3酶标仪测定条件
酶标仪测定波长为150nm1
7.3别定步骤
进·地
鑫术松试过念所核试剂的温度均应回升至室温温人洗谦缓冲液证为300%
7.3.1将测定需用的微孔板备齐并插入微扎架上，记录标推品及样品等在微孔架上的位置。7.3.2吸取201.地塞米松标准溶液（浓度分别为：0.0.025.0.05.0.10.25、0.5、1.0、2.0g/mL)于孔A1,A2 -H1,H2:吸取20 μL样品熔液丁其余微孔中。7.3.3分别吸取100μl.地察米松醇标记物游液于每一个微孔。7.3. 4用封口膜封孔条，并持微孔板在台面上以圆周运动方式混句。7.3.5室温（20℃～24℃）下逝光育30min。7.3.6倒出孔中的液体，将微孔架反扣在吸水纸1反复拍打，以除去孔中过多的残液，然后，立即用洗涤缓冲液按7.2.2条件道行洗板。1）给出该信息是为了方便本标准的使川者·并不表示对某一产品操作步骤的认可。如果其他产品的操作步辨有不同,需经实验评估后采用，
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7.3.7迅速加人150μL显色没于每一个微孔底部，持微孔板在台面上以圆周运动方式滤匀后，于20℃~24℃避光孵育10min。
7.3.8迅速加入150反应终止液于每一个微孔，然后，持微孔板在台通上以阅周运动方式混勾后，将微孔架置于标仪中，在450nm处测量吸光度（加人反应终止液后应在30min内读取吸北度）。7.4平行试验
按以上步骤，对间一标准溶液，同一样品济液均应进行平行试验测定。7.5空白试验
除不称坡试样外，均按上述步骤进行。7.6监控试验
每批试剂金测定前均应分别做添加地塞米松，修他米松、氟经没尼松龙和双氟美松标准品的样品，添加浓度为相应产品的检测低限，8结果计算与表述
吸光度的百分比值为标雅品和的OD控值除以零标准（A1，A2)的平均0I)值，再乘以100，零标准为100%（最大圾光度值）。以吸光度的百分比值为纵坐标（%），地塞类松标过践淤度（ng/ml.)的对数值为横坐标，绘制标准工作曲线。从标谁工作曲线上得到试样中好的残商物强获后，地寒米松、倍他米松和氟羟尼松龙的结果按式(1)进行计算：
X 1 000
样品中残留物的残留总量，单待为微克每千克（/k从标推工作曲线上得到的样品穴戏留物浓坚筑为纳克每毫升（ng/ml）；V—样品溶液的最终定容体积，点升（）
n-样品避液所代表的最终试群质最婵位注：也可以用各种酶标仪的数据处理较推进行针算。9确证试验
新得结多教示位小数
如被测样品中残留物的残留大宇限要求时应期其他方然进行砸证10测定低限和回收率
10.1测定低限
地米松、倍他米松和氟羟凌尼松龙为0.3ug/kg。双氟关松为1.5μg/kg。
10.2回收率
参见附录 B。
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试剂盒组成
附录A
【资料性附录】
地塞米松试剂盒2）
微孔板：96孔(12条×8孔》包皱有地塞米松多抗：地塞米松酶标记物冻干粉：1瓶，根据地塞米松试剂盒中说明，可用酶标物溶解液配制成地塞米松酶标记物溶液：免费标准下载网bzxz
酶标物溶解液:1 瓶 17 mI:
样品稀释:1瓶50 ml-;
洗涤液：10×，1瓶50mL；
显色剂:1瓶18 mJ.1
反应终止液：1瓶18ml.t
地塞米松标准溶液：1瓶50ng/ml.1mL.使用时以样品稀释较分别配制成0.0.025、0.05、0.1.0.25.0.5.1.0.2.0ng/ml.浓度注，式剂盒应在4℃～8℃随光条件下保存·溶解后的酶标记物和抗体溶液需·15℃条件冻存。试剂盒交叉反应性
见表A,1：
表 A.1试剂盒交叉反应性
Dexamethasone(地塑米松）
Betame:hasanet倍地米松)
Triameineslane(羟设尼松龙）
Flumethasare（氟美松）
Prlnie(尼松龙）
Deuxyeuricosrernne（去氧皮质阁）Hydrocorlisone氛化可的松）
6-Mellprectnisolonet6-甲禁微尼松龙）Corieoskerore皮质酮
A.3试剂盒标准曲线
试剂盒标准曲线见图 A.1。
交支反应/%
2，抗州迹思科技有限公司给出该信息是为了方便本标准的使用者并不表示对某一产品的认可。如果其他产品具有和何的教果，需经实验评估后使用这些等效产品。A
ctng'mf.p
标准曲线图
图A.1：
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ym0. 191 In(ei+0, 306
R2-0.9987
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附录B
（资料性附录）
回收率
B.1地塞米松添加浓度及叫收率的试验数据：a）肉类纽织：
一添加量为0.31g/kg时，回收率为70.0%~90.0%一添加量为3μg/kg时，回收率为74.3%~87.0%；添加拨为10g/kg时，回收率为62.6%~92.1%：b）水产品：
添加量为0.3送收率为0%53
一添加量为3g前尚收率为？
一添加量为10g压g收教实
e）牛奶
一添加量为0.3g/kg时，回率
：~添加量为3μg/kg时回收率为10
一添加量为10ug/时，回收率知865%~113.0B.2倍他米松添加浓度及回按率的试验数据：a）肉类组织：
添量为0.
添加量为31g/kg时，回收率为748%添加量为10 g/k降通收率为2%~92h）水产品：
添加载为0.3添g时回收套为70.0%10333
添加量为3感时收率
100路
为86%~-11
添加量为10，国收
牛奶：
添加量为0.3/g时
收率为，0
添加量为3/时国收书为
一矫加量为10g/微时，间收率数0.5%B.3氟泼尼松龙添加浓度及问收率验数据：a）闪类纽织：
添加量为0.3/kg时可收率为66.7%~96.7%：添加载为3g/kg时，回收率为70.3%～99.0%，添加量为10μg/kg时，同收率为80.9~106.1%：b）水产品：
添加量为0.3μg/kg时，回收率为70.0%~96.7%一一添加量为3/k时，回收率为78.0%~100.0%；—添加量为10g/kg时，回收率为82.1%～10z.0%；r）牛奶：
一添加量为0.3g/kg时，同收率为66.7%~93.3%：添加量为3μg/kg时.回收率为70.3%～87.0%；E
添加量为10g/kg时，回收率为75.6%~99.5%；B,4双氟美松添加浓度及回收率的试验数据：a）肉类组织：
一添加量为1.5±g/kg吋，回收率为78.0%～100.0%；一添加量为3产g/k时，回收率为81.7%~100.0%：一添加量为15μg/kg时，回收率为83.3%~106.7%：b）水产品：
添加量为1.5pg/kg时，回收率为74.3%～87.0%；添加最为3μg/kg时，回收率为75.0%～101.7%；-添加量为15μg/kg时，回收率为80.0%~106.7%，牛奶，
添加量为1.54双kg时，回收率为66.7%~90.0%；一添加量为3μg/k时收率为75. 0%~55.7%添加为15gg上率为3%~100.0%
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SN/T1970--2007
Foreword
Annex A and annex B of this standard are informative annexes,This standard was proposed by and was under the charged af certification and acereditation adinini-station af the People's Republic of China.This standard was drafted by Zhejiang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau of the People'sRepublic of China.
The standard was mainly drafted byFeng-xiao Zhang,Wei-liang Shi.This standard is a professional standard for entry-exit inspection and quarantine promuigated for thefirst time.
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Determination of dexamethasone, betamethasone,triameinolone and fiumethasone residues in foodstuffs of animal origin for import and export-Enzyme-linked immunosorbent assay1scope
This standard specifies the methods of determination by ELisA method of dexamethasone,beta-methasone, triameinolone and flumethasone residues in foodstuffs af animial origin.This standard is applicable to the screening determination af dexamethasone. betamethasone,triameinolone and flumethasone residues in meat. aquatic product, milk and milk pawder.2Normativereferences
The following normative documents contain provisions which, through reference in this text, con-stitute provisions of this Professiona! Standard. For dated references, subsequent amendments to,or revisions of, any of these publicatians do not apply. However, parties to agreements based inthis Professional Standard are encouraged to investigate the possibility of applylng the most recenteditions of the normative documents indicated below. For undated references, the latest editian ofthe normative document referred to applies.GB/T 6379 Accuracy of test methods The repeatability and reproducibility of standard test meth-ods based on inter-laboratcry validation,GB/T 6682 Water for analytical laboratary use--Specification and test methods3Preparation and storage of sample.3. 1 Preparation of sampfe extraction.For tissue samples: About 1 0o0 g representative samples should be taken frorn the whole primarysample by quartation, then grinded and blended by a tissue blender to produce homogenous samples,put in suitable clean containers, then sealed and labelled.For milk and powder: About 5o0 g representative samples should be taken from the whole primarySN/T 1970--2007
sample by quartation, put in suitable clean containers, then sealed and labelled.3. 2 Storage of sample.
Store sample at - 20c - - 1sc.4Principle
The assay is performed in a polystyrene micrpplate, coated with anti-corticosteroid antibody, whichconstitute the solid phase. Tha,standardsthe,samples.and.the.enzyme conjugate are added to themicroplate wells. During the ffrst frcueation, there.is a competition among the free molecules, likedexamethasone, betamethasore, triameinolone arffurmethiasonel the standards or samples and thecorticosteroid linked to tha enyme-tenizyimne:coniugatey for the,binding sites of the anti-corticoste.roid antibody adsorbed ta the solid phase. After- the 'weshirig step. any unbound molecule is re-moved. The bound enzyme activity is dptermined by:adding an amount of chramogen substrate. Theenzyme converts tha colorless chrornbgen'into a.colored (blue) product, The addition of the stop re. agent leads to a color change fgom blue to yellawr. Ihe-absarbance, measured by a microplate reader(450 nm), is inversely proportfional to the concentration of icortitosteroids in the sample.5 Reagents and materials
Unless specified, all the chemical'reagonts shotd be A, R.grada.5.1
t for the quarfttative/analysis of Dekamethasone(see annex A).Enzyme immunoassay kit
5, 2Mataphasphoric acid
Acetonitrile
n-Hexane.
Dichloromethane.
5.6 0.1% Metaphosphoric acid: dissolve 1 g metaphosphoric acid in 1 L water.Dexamethasonestandard.
5,8Thapreparation of dexamethasone,betamethasone,triameinoioneand flumethasone standardsolutian (100 mg/L), store sample at 4℃ ~8℃.10
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