【商检行业标准(SN)】 美澳型核果褐腐病菌检疫鉴定方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1871—2007
美澳型核果褐腐病菌检疫鉴定方法Identification of Monitinia fructicola (Winter) Honey2007-04-06发布
华人民和国
国家质量监督检验检疫总局
2007-10-16实施
木标准的随录A,附录和附录图为资料乱附录本标准山国家认证认川监督管理委员会提山并H口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：品珊、严进，本标准系首次发布的行业标准
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美澳型核果褐腐病菌检疫鉴定方法SN/T 1871—2007
本标准舰定了梢物检疫中关澳型核果竭瘤病菌Monitiniafrueticola（wimler）loneyl的检疫鉴定方法，
本标准适用一钙对澳型核果褐魔病岗的核头类等蓝敏科果实和尚木的检疫，2原理
2.1分类地位
文名:pataogen uf brow ru-pathogen of twig censer-pathoyen of Arerican brown ru a= slonefruit
学名：Monilinia fructicciu（Winter）Hloney曾用名：Sceroriniafrucicata（winler）Rehr尤啡态：MonitiafructicolaBatru关澳型核果褐膚病菌「Menitinia jruericoie（Winer）llaney：属真菌界（Fungi），了囊菌门（Ascuriycola）了囊岗纳（Asconyreles），案膜H（Hlelvlieles），核盘的科（Selerotiriacee）链核密菌(Monitimia)
病岗既能在来圆引起危声·义能为害储藏期来实。它还可对果实进行潜伏侵染·侵病菊在佬藏期继续传带扩·造般严重损火，能引起核果炎等水呆褐滴病的其菌还有核果褐摘病菌Moniiniaaa和欧洲积仁来褐腐病菌Moniliniafructigena，它们不仅能引起相似的症状，在形态」地与Moniliniafruticota近似。病商在双.F.的分布和责主物参附录A2.2鉴定原理
根据美狭帮核果竭膚病菊在寄主：的症然、形态举特性、生场学特征和PCR特另性扩增片段做为鉴定依据。
3仪器和用具
3.1仪器
生物退微镜（上测员功能），体视显镜，超净下作省，光照生物培养箱人平高压火菌器式高过离心机-pH计,水箱.PR扩增仪,电泳仪,凝成像仪。3.2用具　
塑料盆，测量用尺子.烧杯，角瓶.量篇,试管,培养血(上径9c),载玻片,盖玻片，酒精灯.黑灯（1W.320nm~~380nm).塑料研件.移液器，移液骆吸头，离心.液微罐4试剂和培养基
4.1试剂
凉脂粉，乳酸，马铃薯，筒萄糖.廉脂糖，尤菌双蒸水，氮，V8液.CaCO.SDS.Tris1IC，MgCl，HCFDTA，VaOH，VaOAC，KC，Tris，CTAR，TRF.无水乙得（Fihanol)，苯（Phenol)，汉化乙绽(F)三氟中烷(Calarolarm)乒丙厚(sapoal)乒戊厚(Tsoanyla tohol)/酶K，Ta聚合酶iTT.DNA分了量 Marker(10ohp),特另性引物 ITSl MIcel 和 ITS4 Mlel.:
SN/T 1871—2097
4.2培养基
徽酸性水洋葉培养基.马薯衡鲨糖培养基(IL)A)V8培养基5鉴定方法
5.1症状检查
梭验苗本封，重点查验枝和叶部。症状为帖枯奏和溃，溃疡斑长风彤，中央稍叫陷，灰褥色，边缘紫褐色为时发生流胶·溺条件下·病斑可生处他一性莫：呼辞症妆为十和调萎：如有花，则变、下枯晓腐烂。剪最有疑似症法的枝、花做分离培养。在果实检验时,取有褐色病斑的头做分离培养。冷库佬战期的病果，病斑为黑褐色.温度适企时病斑迟速护人至全果，果肉随之变软、腐烂，戎皱缔、癌成福果。潮湿条件卜，而产牛同心轮纹状排列的灰户至灰祸任霉，只「牛分牛孢子梗束，被潜伏侵染的尽，有些表面有微小的形的坏死斑点，山现灰白色轮纹状层，
5.2保湿培养
无」逆明妮症状的或看似的柴，微保淤检杏，宋实在懿闭的懿料盒C亡--2℃下保淤境养,7d后每天π始检查,立到第14 天,出现褐腐病斑癌状的果做分离培养5.3分离培养
从病健交界处切妆边长为5 mr1~19 mm的样品,7G长酒精消卡10：~-30,效在微酸性培养基1.25C培茶，利菌落山现，镜检。如菌落、菌丝和分生泡子的形态等症与M、fructicoi相似，则立即转到PDA 血 [..
5.4生物学鉴定
将转到PA上的M.la似菌2下黑旁培养4l,用4mm的打孔器在菊格边缘打孔段样，将菌落转移至另外的丝为9erI)A培养Ⅲ中火,22下，12 h光照/12h黑碚培养，光尔为 320 nrm~~38c nm.二8 黑充灯(近紫外灯)2 支,置」培养Ⅲl 方约 15 crm处。培养而观察保留到第？天，境养3d后下始句山测量菌落直径.直卸第天，计算苗落的牛长速度，记录菌落的颜他产孢量，，堆形状利生长遂度。5.5分子生物学鉴定
5.5.1DNA提取
接CTA13方法握取1NA参见附求 B.5.5.2PCR 引物
M. Frucio 的特异性物 ITSl-MIcl 和 ITS-Mfel 序列分别为 5-TAT GCT CGC CAG AGATA ATT-3',和 5'-TGG GTT TTGGHCAGAA GGA CAC T-S。5.5.3PCR扩增
53IPCR反应体系中含有：Ta案合酶缓冲液（23=nmol/LTrisIIC-pII8.45cnmol/LKC1).1. mmol/ Mgl.1. 25 uni: T@g 聚会海. dN1 200 m.齐引物 0. 2 m.5 .稀格 20 倍的NA样品：间吋要改宵阿对照以T'ris ELTA缓冲液代替LVA样品。PCR反成条件为：预变性-91%3mn→变性，9130s，送火67.5℃30s，延仲72℃1.min，30个循还→晟请延神，72%10mim5.5. 4PCR 产物的检测
在0.5文Tl电泳缓冲液中，1,5为琼指赫凝胶电泳.5V/em,C.5光[13 染色20 min,凝胶坡像仪分析结朱，
5.6菌种保藏
将分离菌接在V培养基的斜面：，待斜面表面布满基丝所，村好斜面的益子，置」一20保作。2
6鉴定特征
6.1生物学特性
6.1.1病菌形态
SN/T 1871—2007
菌丝：微酸性培养基1:.形成第一个隔膜前的钙兰南丝，薄，长250um，宽7m~~_0um.1个或逐个分被，髓的分被很案，
分孢\：芽牛,链状排列，椭彤或卵,有时顶部截，人小为（8m--28 ！m）×（5m19u人多数为（12m-16 m)×（8μm-~11）1,透叫，集吋为灰黄色，分4跑梗较短，分枝或不分歧·次端中生分生孢了。微酸性堆养甚基.F，泡了萌发心尘的劳管较长，约700 m1-900m.在选离他了处可有分枝，此特在与M这的短直近孢了处分破多的管这别显著。在芯龄的菌荐和摘的水果上可见瓶模次性孢子，即小型分牛范子，占径2.u~3m：医核：离教的医丝核较少在增养基「形成，菌丝与琦士组织-起形成菌核，在病的果「可山现「的了座，了座层代替了人部分的果皮。了囊密：仪在果园！的辫也福果「个期律地形成：浅褐色.杯状，具柄·成熟后直径5r～2GIn.了囊六小为(102um~-215{rm)×（3m~-13m),之右丝状丝-内生子粪孢子个,单列.椭阅形.无色单胞-大小为(6 m~lEμm)×（μmm)，而M.frutirota的近似种M.la.ra和Mfructgnu很少生了囊，
6.1.2菌落特征
M.frlctirotu在PDA落表基「的生长速度很快.5d～15d后菌落可布满整个cr的培养Im.承21h生长9 mm~20 n-m,平均13 nn/2h菌落绝丰富，菌落颜色为续了色或成黄色边缘完整质地均勾，同心轮纹听壶，老龄因落产牛不规则一座光和平圆形菌核，小型分生孢子大最集在需落的边缘，为肉眼可地的熙色的突起，M.了ruriirmn与近似菌的菌落特征比较参见附录（。6. 2PCR特异性产物
Mructicota的特性抗增片段为a55bp，7 结果判定
根帮美濮型核果妈腐病术的签定特仙（第6章），对分离荫逊行综合判定。如分离菌的所有特性与各鉴定指标物含，可鉴定为美澳型核果褐腐病菌lMunitiniafructicolac（Winter）IIozeySN/T 1871—2097
北关洲
附录A
（资料性附录）
美澳型核果褐腐病菌的分布和寄主印度、H本、毕国、地门中国北京、中国台湾-津乃布韦、南非，皮（待证实)，川拿大，辈西町，美国。
中美及加勘比海坛区
愈地马拉巴亨乌
南美洲
夫洋洲—
-阿根延、陂利维亚.凸、厄瓜多尔、巴拉圭、秘鲁、乌拉尘，委内瑞粒-澳人利亚、新西兰。
法国,奥地利、四狂云(待证实),英冈(待证实)。十要的背士为凿微科果，汇是核果类李属（Prus「.）的李、、桃、洲桃、樱桃、梅李等，还有苹果、梨、葡常，病菌还可在木瓜属（ChueemelesLidl）、山脑（CrataegusL）批杷属（EricboiryuLindl.）,损存属（yeteonieMil）等等「为害。附录B
（资料性附录）
DNA 提取方法
将岗丝放人.ml.浸在液氮里的离心管守，用蜘料的娠碎，圳人309 μ[~0) μl.（TA缓冲液(H含0.|岳白陈 K)混钧.6C水游1h:13 00c 离心 i:～10 imin保智「清液:c0 . Tri饱和酚：三氯中烷：只成体积为25：24：1)混勾：13000离心5min~12mim.保留[清液；再加500μ三疯中烷：元戊尊（体积为21：1)禄，13000离心5=ir~_0 min.保留「消液；加人1 rm另内醇混句：7℃下置 1 .或、20%过改：3 0G0 离心30 rmnin.别 1NA 沉凝:7G%2醇洗IXA 流凝,室温 1燥;用 &C m~-5C 叫 Tris EDTA 缓冲液溶解 DA,符月。额件
菌落作状
1.长长度（内）
产衔建
压下有轮纹状
乒夺有莲座妆
过综乐节裂妆
附录℃
（资料性附录）
美澳型核果褐腐病菌菌落和形态特征表C.1美澳型核果褐腐病菌菌落”Meli frtieote
榛广急吃黄色
: rrm-2 mm
Monitima un
榛广色叔黄台
2 mr-lI mm
有时有
在1'DA美其132℃、12b近紫外光照/1211黑嗒的培养假来科将菌：囊
了囊改侧丝
子核苞→：
分生孢一及分生孢子链：
分生袍了钳一部分！下载标准就来标准下载网
发的分牛非。
图C.1形态特征
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SN/T 1871—2007
Munitini fresigena
真色玻奶油色
0 ---m-_2 r
有对有
SN/T18/1-200/
中华人民共和国出人境检检校
行业淮
美澳型核果褐腐病菌检疫鉴定方法SN/T [71-200:
中国标准出版社出版
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20年6月第
2年6第
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印数- 2 0
3号：156·21780
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20021Z81 L/NS
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