【商检行业标准(SN)】 食品中致病菌检测方法 实时PCR法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1870—2007
食品中致病菌检测方法
实时PCR法
Detection of pathogensin food Real-timePCRMethod2007-04-06发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2007-10-16实施
本标准的附录A、附录B均为规范性附录本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T1870—2007
本标准主要起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、深圳太太基因工程有限公司、中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局、中华人民共和国汕头出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局本标准主要起草人：曹际娟、卢行安、肖性龙、李苏龙、孙杰、李丽、许业莉、顾鸣、谢昭聪、朱海、张经纬。
本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。I
http：//foodmate.net1范围
食品中致病菌检测方法实时PCR法SN/T1870—2007
本标准规定了食品中沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、空肠弯曲菌、肠出血性大肠埃希氏菌O157：H7、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌的实时PCR检测方法，
本标准适用于食品中沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、空肠弯曲菌、肠出血性大肠埃希氏菌O157：H7、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌的快速检测。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求出口食品中沙门氏菌检验方法
SN0170
SN0172
SN0173
SN0174
SN0175
出口食品中金黄色葡萄球菌检验方法出口食品中副溶血性弧菌检验方法出口食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌检验方法出口食品中空肠弯曲菌检验方法SN/T0184.1进出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检验方法SN/T0973进出口肉及肉制品中肠出血性大肠杆菌O157：H7检验方法SN/T1022出口食品中霍乱弧菌检验方法NMKLNo.156食品中致病性弧菌的检测和计数3定义、术语和缩略语
下列定义、术语和缩略语适用于本标准。3.1定义和术语
实时荧光PCR
Rreal-timefluorescentPCR
实时荧光聚合酶链式反应。
Ct值cyclethreshold Ct
每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。3.2缩略语
polymerasechainreaction
聚合酶链反应.简称PCR，
ht
ITETTETT
SN/T1870—2007
deoxyribonuleic acid
脱氧核糖核酸。
dNTPdeoxyribonucleoside triphosphate脱氧核苷酸三磷酸。
dATpdeoxyadenosinetriphosphate脱氧腺苷三磷酸
dCTPdeoxycytidinetriphosphate脱氧胞苷三磷酸。
dGTPdeoxyguanosinetriphosphate脱氧鸟苷三磷酸。
deoxythymidine triphosphate
脱氧胸苷三磷酸
dUTP deoxyuridine triphosphate脱氧鸟苷三磷酸。
uracil N-glycosylase
尿嘧啶N-糖基化酶。
Thermus aquaticu
水生栖热菌。
stris(hydroxymethyl)aminomethane三(羟甲基)氨基甲烷。
6-carboxyfluorescein
6-羧基荧光素。
6-carboxytetramethylrhodamine6-羧基四甲基罗丹明。
测定方法
4.1方法提要
在PCR基础上，加入一条与模板DNA匹配的、两端有荧光基团标记的寡核首酸探针。PCR每进行一次循环，合成的新链数与释放的荧光基团数呈对应关系，即PCR产物的量与荧光信号的强度呈对应关系。当荧光信号超过所设定的阈值（Threshold-value)时，荧光信号可被检测出来，仪器检测荧光基团的增加量可以间接地体现目的片段的扩增量。2
ht
hodmatenet
SN/T 1870—2007
样品的模板DNA进行实时PCR扩增，观察实时PCR的增幅曲线，从而对食品中的致病菌进行快速检测。
4.2设备和材料
4.2.1实时PCR仪。
4.2.2离心机。
4.2.3微量移液器和灭菌吸头：10μL,100μL,200μL,1000μL。4.2.4恒温培养箱。
4.2.5恒温水浴锅。
天平。
4.2.7均质器或乳钵。
4.2.8灭菌三角烧瓶：500mL.250mL。灭菌吸管：10mL。
灭菌平Ⅲ：90mm×15mm。
灭菌试管：内径3mm，长5cm。
接种棒、镍铬丝。
4.2.13试管架、试管篓。
废液缸。
4.3试剂
除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，水为灭菌双蒸水。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。4.3.1水：应符合GB/T6682中一级水的规格。4.3.2TaqDNA聚合酶
4.3.3dNTP:dATP、dTTPdCTP.dGTP。4.3.4DNA提取试剂：称取0.1gchelex100粉末，加人100mL灭菌蒸馏水中，摇匀即可，也可使用商业化的DNA提取试剂盒。
4.3.510XPCR缓冲液：200mmol/LTris-HCl（pH8.4），200mmol/L氯化钾（KCI）15mmol/L氯化镁（MgCl）。
4.3.6引物和探针：引物和探针序列见表A.1.其中探针的5端标记FAM,3端标记TAMRA。4.4检测步骤
4.4.1样品制备、增菌培养和分离沙门氏菌的样品制备、增菌培养和分离步骤参照SN0170进行。金黄色葡萄球菌的样品制备、增菌培养和分离步骤参照SN0172进行小肠结肠炎耶尔森氏菌的样品制备、增菌培养和分离步骤参照SN0174进行。食品中单核细胞增生李斯特氏菌的样品制备、增菌培养和分离步骤参照SN/T0184.1进行。空肠弯曲菌的样品制备、增菌培养和分离步骤参照SN0175进行。肠出血性大肠杆菌O157：H7的样品制备、增菌培养和分离步骤参照SN/T0973进行。副溶血性弧菌的样品制备、增菌培养和分离步骤参照SN0173进行。霍乱弧菌的样品制备、增菌培养和分离步骤参照SN/T1022进行。创伤弧菌和溶藻弧菌的样品制备、增菌培养和分离步骤参照NMKLNo.156进行。4.4.2模板DNA的制备
4.4.2.1增菌液模板DNA的制备
取4.4.1中培养的相应致病菌增菌液（需二次培养的则取二次增菌液）1mL，加到1.5mL无菌离心管中，8000r/min离心5min，吸弃上清：加入50uLDNA提取液（使用前室温解冻并充分混，快速吸取）.混匀后沸水浴5min，12000r/min离心5min，取上清保存于一20C备用以待检测雪品伙伴欧ht
TTTEITETT:
SN/T1870—2007
4.4.2.2可疑菌落模板DNA的制备挑取4.4.1中分离到的可疑菌落或菌体，加入50μLDNA提取液，再按照4.4.2.1步骤制备模板DNA以待检测，
也可使用商业化的DNA提取试剂盒并按其说明制备模板DNA。4.4.3实时PCR检测
4.4.3.1反应体系体积为25uL：10XPCR缓冲液2.5μL、引物对（10μmol/L）各1μL、dNTP(10mmol/L）1uL、TaqDNA聚合酶（5U/μL)0.5uL、水17μL、模板DNA2μL。4.4.3.2反应条件：37℃5min.95℃预变性3min，94C变性5s，60℃退火延伸40s.同时收集FAM荧光，进行40个循环，4C保存反应产物注：PCR反应参数可根据基因扩增仪型号的不同进行适当的调整4.4.3.3检测过程中分别设阳性对照、空白对照。阳性对照为扩增片段的阳性克隆分子DNA或阳性菌株DNA，空白对照为无菌水。
5结果及判断
5.1质控标准
阴性对照：无扩增曲线，C≥40：一阳性对照：出现典型的扩增曲线，C值应<30.0。否则，实验视为无效。
5.2结果判定和报告
-C值≥40，可判定样品结果为阴性，可直接报告未检出相对应致病菌；C.值≤35.0，可判定该样品结果为阳性：C.值>35.0而<40，建议样本重做。重做结果C.值≥40者为阴性，否则为阳性。对于阳性结果，应参见规范性引用文件中的方法或相关的国际权威微生物经典检验方法做进一步的生化鉴定和报告。
6测定低限
在上述条件下，本方法对于各致病菌的测定低限见表1。表1食品中11种致病菌的测定低限致病菌名称
沙门氏菌
志贺氏菌
金黄色葡萄球菌
小肠结肠炎耶尔森氏菌
单核细胞增生李斯特氏菌
空肠弯曲菌
测定低限/（CFU/mL）
废弃物处理和防止污染的措施
致病菌名称
肠出血性大肠埃希氏菌O157：H7副溶血性弧菌
霍乱弧菌
创伤弧菌
溶藻弧菌
测定低限/（CFU/mL）
检测过程中的废弃物，收集后在焚烧炉中焚烧处理。检测过程中防止交叉污染的措施见附录B，8生物安全措施
为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测致病菌，所有培养物应小心处置。并参见GB19489中的有关规定执行。
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致病菌名称
沙门氏菌
志贺氏菌
金黄色
葡萄球菌
小肠结肠炎
耶尔森氏菌
单核细胞增生
李斯特氏菌
空肠弯曲菌
肠出血性大肠
埃希氏菌
0157:H7
副溶血性弧菌
霍乱弧菌
创伤弧菌
溶藻弧菌
附录A
（规范性附录）
食品中致病菌实时PCR检测所用引物和探针序列表A.1
食品中致病菌实时PCR检测所用引物和探针序列引物序列
5°-GCGGCGTTGGAGAGTGATA-3*
5′-AGCAATGGAAAAAGCAGGATG-3
5'-CGCAATACCTCCGGATTCC-3'
5°-TCCGCAGAGGCACTGAGTT-3*
5*-TTCTTCACGACTAAATAAACGCTCA-3*5′-GGTACTACTAAAGATTATCAAGACGGCT-3'5'-AAGAAGGCCTTCGGGTTGTAA-3\5′-TTCTGCGAGTAACGTCAATCACA-3\5'-CTGAATCTCAAGCAAAACCTGGT-35°-CGCGACCGAAGCCAACTA-3
5′-TTGGTATGGCTATAGGAACTCTTATAGCT-3'5′-CACACCTGAAGTATGAAGTGGTCTAAGT-3\5′-TCCTCAGCTATAGGGTGCTTTTG-35′-ATCGAAACAAGGCCAGTTTTTTAC-3'5'-GCGACCTTTCTCTGAAATATTAATTGT-35°-CATTCGCGTGGCAAACATC-3'
5°-GCTTTATTGTTCGATGCGTTAAAC-35′-GATGCCAAAATTGTGCGTATCA-35′-TGTTTATGGTGAGAACGGTGACA-35′-TTCTTTATCTAGGCCCCAAACTTG-3*5′-GAGCTTTCTGTTGAATGTAACGACAC-3\5′-ACCCACACGCTCCATTGC-3\
httr
探针序列
SN/T1870—2007
5′-CATTTCTTAAACGGCGGTGTCTTTCCCT-35*-AACAGGTCGCTGCATGGCTGGAA-35'-CAGAACACAATGTTTCCGATGCAACGT-35'-ATTAACCTTTATGCCTTCCTCCTCGCTG-3\5′-ATACGATAACATCCACGGCTCTGGCTGG-3\5'-ATGGCATATCCTAATTTA-3'(MGB)5′-TATTTTTCCGAGTACATTGGCATCGTGTGG-35'-CGCACAAGGCTCGACGGCTGA-3\5°-TCTTGGGCAATCGCATCGGTTGA-3\5'-CCGTTAACCGAACCACCCGCAA-3
5'-TCTCTGCAAACTCAGACGCAAGCGTAGG-3\5
foodmate.net
SN/T1870—2007
B.1抽样和制样过程
附录B
（规范性附录）
检测过程中防止交叉污染的措施抽样和制样工具必须清洗干净，经121C高压灭菌15min～20min。一套洁净工具限于一份样品使用。存放样品的容器应该经过清洗、高压，或为一次性灭菌容器。B.2检测过程
B.2.1实时PCR实验室应分为样品制备区、前PCR区（反应混合物配制区）、PCR区（检测区）。将模板提取、PCR反应液配制、PCR循环扩增等步骤分区或分室进行。实验室的运作应从\净区到“脏区”单向进行。
B.2.2实验过程中，应穿戴实验服和手套，手套要经常更换。各区要有专用实验服，经常清洗。B.2.3
各区所有的试剂、器材（尤其是移液器）、仪器都应专用，不得带出该区。B.2.4所有溶液、水、耗材和器具要121C、15min高压，避免核酸和（或）核酸酶污染。每种溶液应使用高质量的成分和新蒸馏的双蒸水。在20℃～25℃贮存的试剂中，可加入0.025%的叠氮钠。所有试剂应该以大体积配制，然后分装成仅够一次使用的量进行贮存。5DNA模板或引物的离心管打开之前，要简短离心，离心管不能用力崩开，以免产生气溶胶，B.2.5
前PCR区中，最好能在PCR操作箱中加人PCR反应各组分B.2.6F
实验前后，实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNAB.2.8可使用UNG酶和dUTP系统控制污染，B.2.9www.bzxz.net
应遵循PCR操作的其他要求。
雪品伙伴双ht
TTTEITETT:
SN/T 1870-2007
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
食品中致病菌检测方法实时PCR法SN/T1870—2007
中国标准出版社出版
北京复兴门外三里河北街16号
邮政编码：100045
网址spc.net.cn
电话：6852394668517548
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本880×12301/16印张0.75字数13千字2007年7月第一版2007年7月第一次印刷印数1—2000
书号：155066：2-17799
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定价8.00元
200Z—0Z81 L/NS
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