【农业行业标准(NY)】 乳及乳制品中乳糖的测定 酶-比色法

ICS67.050
中华人民共和国农业行业标准
NY/T1422-2007
乳及乳制品中乳糖的测定
酶一比色法
Determination of lactose in milk and milk productsEnzyme-colorimetric method
(IDF79B:1991, Dried milk, dried ice-mixes & processed cheesedetermination of lactose content enzymatic methods,MOD)2007-06-14发布
2007-09-01实施
中华人民共和国农业部
NY/T1422—2007
本标准修改采用IDF79B：1991《乳粉、冰淇淋粉和加工干酪中乳糖含量测定一酶法》（英文版）。本标准根据IDF79B：1991重新起草。考虑到我国国情，本标准与该国际标准的主要差异如下：试剂部分增加酸度调节剂氢氧化钠、硫酸以及酶试剂硫酸铵的配制方法；-增加试样制备一章，包括液体、固液体、固体试样的制备；分析步骤中增加标准曲线的绘制，由试液吸光度测定与标准系列比较定量，不采用国际标准中摩尔吸光系数计算定量；
以试剂空白和试液空白扣除干扰组分和葡萄糖本底值，不采用国际标准中吸光度减量计算；免去国际标准中预试验和试验报告章条；增加附录A，规定酶的技术要求、试验方法及判定规则；编写格式、用语遵照我国标准GB/T1.1一2000《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则》和GB/T20001.4一2001《标准编写规则第4部分：化学分析方法》。本标准的附录A为规范性附录。
本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中国科学院沈阳应用生态研究所农产品安全与环境质量检测中心。本标准主要起草人：王颜红、林桂凤、王世成、张红、杨玉兰、齐伟。1范围
乳及乳制品中乳糖的测定酶一比色法本标准规定了乳及乳制品中乳糖含量的酶一比色法测定方法。本标准适用于乳及乳制品中乳糖的测定。本标准试液的检出限为0.5ug/mL。2规范性引用文件
NY/T1422—2007www.bzxz.net
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准。然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理
在β-半乳糖苷酶(β-GLS)催化下，乳糖被酶解为D-葡萄糖(G)和D-半乳糖(GL)。已糖激酶(HK)将D-葡萄糖磷酸化生成6-磷酸葡萄糖（G6P),同时将三磷酸腺苷（ATP)转化为二磷酸腺苷（ADP)。受6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)催化，6-磷酸葡萄糖氧化为6-磷酸葡萄糖酸(GA6P),同时烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+）被还原成还原型烟酰胺腺嘌岭二核苷酸磷酸（NADPH)。在波长340nm处NADPH的吸光度值与乳糖含量成正比，与标准系列比较定量。GLS-D-C:Hi20(G)+ D-CH120(GL)C2H22Ou(L)+H,0-
D-C,H2Q(G)+ATPG6P+ ADP
4试剂
6PDH-GA6P+ NADPH+ H+
G6P+NADP++HO-
除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂，实验用水应符合GB/T6682的规定。4.131g/L亚铁氰化钾溶液
称取3.55g三水亚铁氰化钾(K4[Fe(CN)]·3H,O)溶于水，稀释至100mL，混勺。4.240g/L硫酸锌溶液
称取7.13g七水硫酸锌(ZnSO4·7H2O)溶于水，稀释至100mL，混匀。4.32mol/L硫酸溶液
警告——稀释浓硫酸时应当将硫酸缓慢加入水中，且不断搅动。否则会引起爆炸。用水稀释浓硫酸Vi.0+Vg.00
4.44g/L氢氧化钠溶液
称取0.4g氢氧化钠（NaOH)溶于水，稀释至100mL，混匀，置于聚乙烯塑料瓶中。4.5200g/L氢氧化钠溶液
称取20.0g氢氧化钠(NaOH)溶于水，稀释至100mL，混匀，置于聚乙烯塑料瓶中。4.6422g/L硫酸铵溶液
称取42.2g硫酸铵（(NH4）2SO4）溶于水，稀释至100mL，混匀。NY/T1422—2007
4.7柠檬酸缓冲溶液，pH6.6
称取2.8g二水柠檬酸三钠（CHsO,Na3·2H2O)，0.042g一水柠檬酸（CHgOH2O)和0.625g七水硫酸镁（MgSO4·7HO)，溶于约40mL水中，混匀。用2mol/L硫酸溶液(4.3)或4g/L氢氧化钠溶液(4.4)将pH调至6.6±0.1,定容至50mL，混匀后放置0℃~4℃冰箱中，可保存3个月，使用前放置至室温。4.8三乙醇胺(TEA)缓冲溶液，pH7.6称取14.0g三乙醇胺盐酸盐（CgH1sNO·HCI)，0.25g七水硫酸镁（MgSO·7H2O)溶于约80mL水中，用200g/L氢氧化钠溶液（4.5)将pH调至7.6±0.1,稀释至100mL，混匀后放置0℃~4℃冰箱中，可保存2个月。
4.9NADP+-ATP-TEA缓冲溶液
称取65mg烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐（C2iH26N.OzP3Na2，纯度98%~99%）和170mg5-三磷酸腺苷二钠盐（C1oH4N,O13P3Na2，纯度99%~100%），溶于30mL三乙醇胺缓冲溶液（4.8）中，混匀后放置0℃～4℃冰箱中，可保存2周，使用前放置至室温。4.10β-GLS-(NH4)2SO4悬浊液
将β半乳糖苷酶（β-GLS，埃希氏大肠杆菌，EC3.2.1.23)加422g/L硫酸铵溶液（4.6)中，使β-半乳糖苷酶的活性不低于60IU/mL（技术要求应符合附录A的规定），缓慢搅勾成悬浊液后放置0℃~4℃冰箱中，可保存12个月。使用时该悬浊液的容器应浸人冰水中。4.11HK-G6PDH-(NIL)2SO4悬浊液将已糖激酶（HK，酵母，EC2.7.1.1)和6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDH，酵母，EC1.1.1.49)加人422g/L硫酸铵溶液（4.6)中，使已糖激酶的活性不低于280IU/mL（技术要求应符合附录A的规定），6-磷酸葡萄糖脱氢酶的活性不低于140IU/mL（技术要求应符合附录A的规定）,缓慢搅匀成悬浊液后放置0℃～4℃冰箱中，可保存12个月。使用时该悬浊液的容器应浸人冰水中。4.12乳糖标准溶液
称取经87℃干燥至恒重的一水乳糖(C12H22O1·H2O)0.842g，精确到0.0001g，溶于水中，定容至100mL，摇匀。准确吸取1.00mL上述溶液，用水定容至100mL，即得80μg/mL乳糖标准溶液，现用现配。
5仪器
实验室常规仪器及以下各项：
5.1分析天平：感量0.1mg。
5.2比色管：10mL，带盖。
5.3紫外可见分光光度计：340nm，1cm比色血。5.4恒温水浴锅：±1℃。
5.5组织捣碎机。
6试样制备
6.1固体试样
取有代表性的样品至少20g，用组织捣碎机（5.5)捣碎均匀，置于密闭的玻璃容器内。6.2固液体试样
取有代表性的样品至少200g，用组织捣碎机(5.5)捣碎均匀，置于密闭的玻璃容器内。6.3液体试样
取有代表性的样品至少200g，充分混匀，置于密闭的玻璃容器内。7分析步骤
7.1试液制备
NY/T1422-—2007
用分析天平（5.1)称取试样，放置于100mL玻璃烧杯中，固液体试样或液体试样称取2g，固体试样称取0.2g，均精确到0.1mg。加人约20mL40℃～50℃热水，搅匀成乳浊状或悬浊状试料，转移至250mL容量瓶中。用刻度移液管依次加人5.0mL亚铁氰化钾溶液（4.1）,5.0mL、硫酸锌溶液（4.2）和10.0mL4g/L氢氧化钠溶液（4.4)，每次加人后均应充分摇匀。定容，混勾，静置30min，过滤，弃去最初滤液约30mL。吸取5.00mL滤液于100mL容量瓶中，定容，即为试液。7.2标准曲线绘制
用微量移液管吸取0.00,0.20,0.400.60，0.80，1.00mL乳糖标准溶液（4.12），分别置于10mL比色管（5.2）中，各加入0.20mL柠檬酸缓冲溶液（4.7），0.05mLβ-GLS-（NH）2SO4悬浊液（4.10）摇匀，于36C±1C恒温水浴锅（5.4）中恒温15min。取出后加人1.00mLNADP+-ATP-TEA缓冲溶液（4.9），0.05mLHK-G6PDH-（NH4）2SO4铵悬浊液（4.11），摇匀，于36℃±1℃恒温水浴锅中恒温60min。取出后，冷却至室温，用水定容至5.00mL，摇匀，放置5min。用1cm比色血，以乳糖标准溶液含量为0.00的试剂溶液作参比，在波长340nm处测定各比色管内溶液的吸光度。以乳糖含量为纵坐标，以吸光度值为横坐标，绘制标准曲线。7.3试液的测定
用微量移液管吸取1.00mL试液（7.1），置于10mL比色管中，加入0.20mL柠檬酸缓冲溶液，1.00mLNADP+-ATP-TEA缓冲溶液，0.05mLHK-G6PDH-（NH)2SO悬浊液，摇匀，于36℃±1C恒温水浴锅中恒温60min，取出，冷却至室温，用水定容至5.00mL，摇匀。此溶液即为空白溶液。用微量移液管吸取1.00mL试液（7.1），置于10mL比色管中。以下按7.2各加人0.20mL柠檬酸缓冲溶液（4.7).....用1cm比色皿”操作，以空白溶液作参比，在波长340nm处测定比色管内试液的吸光度，在标准曲线上查出对应的乳糖含量。8结果计算
乳及乳制品中乳糖的含量，数值以克每百克（g/100g）表示，按下式计算：cV.V3
X=10000mVzV
式中：
X——乳及乳制品中乳糖的含量，单位为克每百克（g/100g)；-标准曲线上查出的试液中乳糖的含量，单位为微克（ug)；c
试料的质量，单位为克（g）；
Vi——试料经脱蛋白处理后的定容体积，250mL；V2——吸取滤液体积,5.00mL；
V3——滤液定容体积,100mL；
V4—吸取试液体积，1.00mL。
两个平行样测定算术平均值的计算结果保留3位有效数字。9精密度
9.1重复性
在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于这两个测定值算术平均值的6%。
NY/T1422-2007
9.2再现性
在再现性条件下获得的两次独立测试结巢的纯对差值不大于这两个测定值算术平均值的14%。A8t
中中联雕容
0o.1.08.0.
成事新新您
空行合附浆
的容器应被
水庭赛殖
008克
Vr00001
分单情：
附录A
（规范性附录）
NY/T1422-2007
β-半乳糖苷酶、已糖激酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶的技术要求、试验方法及判定规则A.1技术要求
β半乳糖苷酶、已糖激酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶按其活性计算都不应含有大于0.01%的以下各种酶：β-果糖苷酶、淀粉葡萄糖苷酶、纤维素酶、α-糖苷酶、葡萄糖脱氢酶和NADPH氧化酶。A.2试验方法
用微量移液管吸取0.8mL乳糖标准溶液（4.12），置于10mL比色管（5.2）中，加人32ug/mL的蔗糖（分析纯）、可溶性淀粉（分析纯）、麦芽糖（生化纯）和纤维二糖（生化纯）的混合溶液1mL。以下按7.2“加入0.02mL柠檬酸缓冲溶液（4.7)….在波长340nm处测定比色管内溶液的吸光度。\操作。在标准曲线（7.2）上查出对应的乳糖含量。乳糖的测定回收率以质量分数（%）表示，按下式计算：式中：
0.8×80×100
-从标准曲线上查出的试液中乳糖含量，单位为微克（μg)。A.3判定规则
乳糖测定回收率，如在85%~120%范围内，则判定β-半乳糖苷酶、已糖激酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶符合技术要求。
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