【水产行业标准(SC)】 斑节对虾杆状病毒病诊断规程 第3部分:组织病理学诊断法

ICS65.020.30
中华人民共和国水产行业标准
SC/T7202.3—2007
斑节对虾杆状病毒病诊断规程
第3部分：组织病理学诊断法
Diagnostic Protocols for Penaeus monodon-Type Baculovirus(MBV)of Penaeid Shrimp
Part 3: Histopathology Method2007 -06 - 14 发布
2007-09-01实施
中华人民共和国农业部发布
SC/T 7202《斑节对虾杆状病声病诊断规程》分为三个部分：第1部分：压片显微镜检查法：
第2部分:PCR检测法；
第3部分：组织病埋学诊断法。
本部分为SC/T7202的第3部分。
本部分的附录A为规范性附录。
本部分由中华人民其和农业部渔业局提山。本部分由全国水产标准化技术委员会归口。SC/T7202.3-2007
本部分起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所、全国水产技术摊广总站。本部分主要起草人：黄徒、杨冰、陈爱平、宋晓玲、史成银、杨丛海、魏琦。1范围
斑节对虾杆状病毒病诊断规程
第3部分：组织病理学诊断法
SC/T 7202.3-2007
SC/T7202的本部分规定了斑节对虾杆状病毒病组织病理学诊断法的原理、试剂与材料、仪器设备、操作步骤和结果判定。
本部分适用F对虾感染MIBV情况的确诊或未知疾病样品的组织病理学评价。不适」对病毒的非感染性携带的标本进行病毒检测。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标推的引用而成为本标准的条款，凡是注日期的引用文件，其随底所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。SX/T7202.1—2007斑节对虾杆状病毒病诊断规程第1部分：乐片显微镜检查法3原理
：3.1斑节对虾杆状病毒病的病原和病理学特征斑节对虾杆状病毒（Pemaeasmiomordon-typebacailovirus,MBV)是封闭性杆状病毒，核酸类型为双链DNA，按国际病毒分类委员会的命名规则，MRV也被称为PmSNPV(斑节对虾单粒包膜的核型多角休病毒)。
MBV是宿主虾的幼休，仔虾和早期幼虾的潜在严病原，该病毒具有泛的宿主范国，其感染的特征是在感染的肝胰腺和中肠上皮细胞中存在细胞核内的色涵体，即核型多角包涵体，该包涵体也可在类使中游离存在。拥挤、化学药物胁迫或环境胁迫可增强MBV在宿主中的流行，其传播途径主要是有自相残食和类一口途径的经口传播，3.2技术原理
苏木精一伊红(H-E)染色在组织学和病理学中是一种常规染色方法。：通过染色液、苏术精和伊红与组织细胞的不同组分分别相结合，使细胞核、细胞质和细胞内其他结构产生反差明显的蓝紫色和红色，而可清晰地观察到各种不间的组织结构病理变化。4试剂和材料
，4.1除非另有说明，在分析中仪使用确认为分祈纯的试剂和燕缩水或去离子水或相当纯度的水。4.2右蜡（熔点52℃-54℃）：切片级，4.3二甲米。
4.4无永乙醇。
4.595%乙醇。
4.6过滤海水：盐度为20--30的海水在室内放置1周后，经滤纸和0.22um滤膜过滤。4.7戴继森氏AFA(Davidson'sAFA)固定液按附录A的规定执行4.8迈尔一班尼特苏不精(Maycr-BennettHematoxylin)染色液按附录A的规定执行。SC/T 7202 .32007
4.9伊红一焰红染色液按录A的规定执行4.10黏片剂按附录A的规定执行。4.1185%乙醇按附录A的规定执行。4.1280%乙醇按附录A的规定执行，4.1375%乙醇按附录A的规定执行。4.1450%乙醇按附录A的规定执行，4.15阳性对照为受MEV感染的对虾制成的组切片。4.16
阴性对照为未受MV感染的对虾制成的组织切片。5仪器设备
5.1石蜡切片机：满足4um7um厚度的石蜡连续切片要求，5.2程控组织脱水机或使用手工脱水步骤。5.3石蜡包现机或使用手工包趣步骤：满足石蜡切片机对名蜡块规格的要求。5.4程控切片染色机或使用手工染色步骤，5.5展片水浴锅：激口，无盖水浴锅。5.6平板烘片机：室温100
5.7显微镜：带高倍镜（40×）利汕镜（100×）5.8毛笔。
5.9小子。
5.10载玻片，
5.11盖皱片。
5.12玻片架。
3荧光显镜（阻挡滤北片波长为520m，激发滤光片波长为450mm490nm），6操作步骤
6.1样品准备
6.1.1样品采集的要求和固楚方法按SC/T7202.1--2007（斑节对虾杆状病毒病诊断规程：第1部分：压片显微镜捡查汰)附录B的规定执行，6.1.2在制作切片前，按照SC/T7212.1—2007（斑节对虾杆状病毒病诊断规定第1部分：压片显微镜检查法)附录B的方法进行取材修整，要保证对虾的肝胰腺或肠能被切片和染色。6.2脱水
75%乙醇(1 h45 min)-85%Z醇(1 h45 mit)-85%乙醇(1 h 45 min)-95%乙醇(45 min)-95%乙醇(45min)→无水乙醇（45min）光水乙醇(45min)。6.3透明
无水乙醇-二中苯(1:1)(25 in)→二甲苯(20 nirn)--二甲苯(20 min)。6.4浸蜡
纯石（1 h20 min)→纯不蜡(1h 20 min)6.5包埋
用石蜡包埋机进行包埋，
6.6切片
SC/T 7202 :3—2007
用石蜡切片机切片，厚度5m。对每个石蜡包埋块至少切取两块不连续的划片。6.7展片
展片水浴锅(40℃)中片,用涂有一层黏片剂的载玻片捞出，置于平板烘片机上于45℃烘片2he6.8染色
二甲苯(5 min)·二甲苯(5 min)→无水乙醇(2 min)→无水乙醇(2 rmin)→95%乙醇(2 min)→95%乙醇(2 rmin)-→80%乙醇(2 rrin)→8D%乙醇(2 min)→50% 乙醇(2 min)-+蒸馏水(2 min)→蒸馏水(2nin）→蒸馏水（2rnin）一→迈尔一班尼特苏本精（Mayer-BennettHematoxylin）染色液（5min）→缓慢流动的白来冰(6 min)→伊红一焰红染色液(2 rin)~95%乙醇(1 min 20 s)→95%乙醇(2 min)-无水乙醇(2min)-→无水乙醇(2 min)-二甲苯(2 min 30 s)→二甲苯(2 nin 30 s)→+-甲本(2 min 30 s)。6.9封片
滴加2滴中性树胶封片。
6.10观察
明视野显被镜下观察，
7结果判定
7.1感染有MIV的对虾肝胰腺细胞的细胞核明显肥大，内有单个或多个近球形的核型多角体型包涵体，使染色质减少并向边缘迁移。在中肠上皮细胞中也偶尔可君到类似的现象，包涵体呈亮红包。肝胰细胞受感染的比率越大，说明MBV的感染程度越重。7.2在荧光显微锐下可见到在浅绿色的背景中，核型多角体型包涵体量明竞的黄绿色荧光。7.3诊断结果可疑时,补充PCR检测进行结果确认。SC/T 7202.3--2007
A,1 85%乙醇
95%乙醇
加水定容至
混勾，究温贮存，
A.280%乙醇
95%乙醇
加水定容率
混匀,室温存。
A.375%乙醇
95%乙醇
水定容至
混勾，密温贮存。
A.470%乙醇
95%乙醇
加水定容至
混句，室温贮存。
A.550%艺醇
95%乙醇
加水定容至
混幻，案温贮存。
附录A
（规范性附录】
试剂配方
6戴维森氏AFA（Davidson'sAFA）固定液A.6
95%乙醇
甲醛(37%）
冰醋酸
海水(用于海洋甲壳类)或白米水混勾，室温密封赋存
A.7R-F固定液免费标准bzxz.net
95%乙醇
中麓（37%）
950 mL
80X)mL
750 ml
500 rmL
330 nL
115 mL
407 mL
海水(用于海洋甲壳类)或自来水222 mL
混勾,加人水(含 28% ～30%NH,)约 22 mL,将 pH调整到6. 0~7.0。室温擀封贮存。
A.8迈尔一班尼特苏木精(Mayer-BemnettHematoxylin)染色液热水
苏本素
碘酸钠
钾明矾
柠檬酸
水介三氯乙醛
按上述顺序混贪，溶解后即可使用，室温贮存。A.91%伊红购存液
伊红Y(水溶性）
溶解后置于棕色瓶中，室温贮存。1%焰红购存液
焰红B(水性)
溶解后置于棕色瓶中，室温贮存。A.11伊红—一焰红染色液
1%伊红照存液
1%红购有液
95%乙醇
冰隋酸
混匀后即可使用，室溢贮存
A.12黏片剂
溶解后，班人：
混勺，在棕色瓶中室温忙存。
1000 mL
500 mL
100 rnL
780 mL
SC/T7202.32007
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