【农业行业标准(NY)】 饲料中三聚氰胺的测定

ICS 65.120
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 1372-2007
饲料中三聚氰胺的测定
Determination of Melamine in Feeds2007-06~14发布
2007-06-14实施
中华人民共和国农业部发布
NY/T1372—2007
本标准参考美国食品药品管理局（FDA）实验室方法和国内相关实验室的方法，提出了饲料中三聚氰胺的测定方法。
本标准的附录A为资料性附录。
本标准由农业部畜牧业司提出。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：国家饲料质量监督检验中心(北京)。本标雁起草人：赵根龙、王培龙、宋荣、索德成、马东霞、张苏、李丽蓓、杨噜明、苏晓鸥。http
1范围
饲料中三聚氢胺的测定
NY/T1372—2007
本标准规定了测定饲料中三聚鼠胺的含量的高效液相色谱法(HPLC)和气相色谱质谱联用法(GC-MS),其中 GC-MS法为确证法。
本标准适用于配合饲料,浓缩饲料,添加剂预混合饲料、植物性蛋白饲料、宠物饲料(干粮、髓头)中三案氰胺的测定。
本标准中 HPLC法最低定量限为 2.0 mg/kz,GC-MS 法最低定量限为 0. 05 mg/kg。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T20195动物饲料试样的制备
3HPLC法
3.1愿理
试样中的三聚氰胺用三氟乙酸溶液提取，提取液离心后经混合型阳离子交换固相萃取柱净化，洗脱物吹干后用甲醇溶液溶解，用高效液相色谱仪进行测定。3.2试剂与材料
除非另有规定，仅使用分析纯试剂和符合GB/T6682的三级水，色谱用水符合GB/T6682一级水的规定。
3.2.1甲醇：色谱纯。
3.2.2乙：色谱纯。
3.2.3氨水：浓度25%28%。
3.2.4混合型阳离了交换固相萃取柱：60mg，3mL。3.2.5三氮乙酸溶液10g/L称取10g三氯乙酸加水至1000mL。3.2.6水甲醇溶液：量取5mL氨水，溶解于100mL甲醇中。3.2.7乙酸铅溶液22g/L：取22g乙酸铅用约300mL水溶解后定容至1L。3.2.8燃膜：0.45μm，有机相。3.2.9甲醇溶液：200mL甲醇(3.2.1)加人800mL一级水，混匀。3.2.10流动相：称取2.02g庚烷磺酸钠和2.10g柠檬酸于1L容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度。取该落液900mL加人100mL乙腩（3.2.2)。3.2.11三桑氰胺标准品（纯度>99%）。3.2.12三聚氰胺标准溶液Www.bzxZ.net
3.2.12.1标准储备液：称取100mg(精确到0.1 mg)的三睾氰胺标准品,用甲醇溶液(3.2.9)溶解并定容于100mL容量瓶中，该溶液浓度为1mg/mL，于4℃冰箱内忙存，有效期3个月.。ht
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3.2.12.2标准中间液：吸取标准储备液5.00mL，于50mL容量瓶内，用甲醇溶液（3.2.9)定容至50mL,该溶液三氰胺浓度为100/mL，于4C冰箱内贮存，有效期1个月。3.2.12.3标准工作液：用移液管分别移取标准中间液1mL、5mL、10mL、25mL.50mL于5个100mL容量瓶内,用甲醇溶液(3.2.9)定容,该溶液三聚鼠胺浓度为1.0 pg/mL、5.0 g/mL10 μg/mL、25g/mL、50g/mL。于4C冰箱内贮存，有效期1周。3.3仪器与设备
3.3.1高效液相色谱仪，配有二极管阵列检测器或紫外检测器。3.3.2离心机：10000 r/ming
3.3.3病旋混合器。
3.3.4超声波清洗器。
3.3.5复吹仪，可控温至60T。
固相萃取装置。
3.3.7高速匀质器。
3.3.8囊式提取器。
3.3.9腹菇摇床。
3.4试样制备
按照GB/T20195的规定制备试样。3.5 测定步票
3.5.1提取
3.5.1.1配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料、植物性蛋白饲料和宠物何料（干粮)中三桑氰胺的提取。称取5g试样（榜确至0.01g），准确加入50mL三氟乙酸溶液（3.2.5），加人2mL乙酸铅溶液(3.2.7)。摇勾，超声提取20min。静止2min，取上层提取液约30mL转人离心管，在10000z/min离心机上离心5 nin。
3.5.1.2宠物伺料（罐头）中三骤氰胺的提取。称取5g试样（精确至0.01g），加人50mL乙醚，摇床上120r/min振荡1h，弃去乙醛，再加人50mL乙醛，摇床上120/min振送1h，弃去乙醛，其余步骤同3.5.1.1.
3.5.2净化
分别用3mL甲醇,3mL水活化混合型阳离子交换固相萃取柱，准确移取10mL离心液分次上柱，控制过柱速度在1mL/min以内。再用3mL水和3mL甲醇洗涤混合型阳离子交换固相举取柱，抽近于后用氨水甲醇溶液（3.2.6)3mL洗脱。洗脱液50C氮气吹于，准确加入甲醇溶液（3.2.9),涡旋振荡1min，过0.45gem滤膜，上机测定。3.5.3液相色谱条件
色谱柱：C柱,柱长150 mm,内径4.6mm,粒度5gum;或性能相当的色谱柱。柱温;室温。
疏动相流速;1.0 mL/rmin。
检测波长：240mm1
3.5.4测定
按照保留时间进行定性，试样与标准品保留时间的对偏差不大于2%，单点或多点校正外标法定量。待测样液中三聚氰胺的响应值应在工作曲线范围内。3.6结果计算和表迹
3.6.1试样中三桑氮胺的含量X，以质意分数毫克每干克(mg/kg)表示，单点校正按式(1)计算：式中
X-AXGXV
As X m
净化后珈人的甲醇溶液体积,单位为毫升(mL);三聚氰胺标准溶液对应的色谱峰面积响应值：试样溶液对应的色谱峰面积响应值；三策鼠胺标准溶液的浓度，单位为微克每旁升(竭/mL)：-试样质量，单位为克（g)；
-稀释倍数。
多点校正按式（2)计算：
武中：
-净化后加人的甲醇溶液体积,单位为毫升(mL);NY/T 1372—2007
标准曲线上查得的试样中三聚氰胺的浓度，单位为微克每恶升（/mL）试样质量，单位为克(g)：
n--稀释倍数。
3.6.2结果衰示
平行测定结果用算术平均值表示，结果保留三位有效数字。3.7重复性
在同-实验室由同一操作人员使用同一仪器完成的两个平行测定的相对偏差不大于10%。4 GC-MS 法
4.1方法原理
试样中的三案氰胺用三氯乙酸溶液提取，经混合型阳离子交换固相萃取柱净化，用N，O双三甲基，硅基三氟乙酰胺(BSTFA)衍生化，以气相色谱质谱联用仪进行定性和定量。4.2试剂和材料
4.2.1衔衍生化试剂：BSTFA+1%三甲基氟硅烷(TMCS)。4.2.2吡啶：优级纯。
4.2.3其他试剂和材料同3.2.1~3.2.8.3.2.11,3.2.12。4.2.4标准工作液：用移液售分别吸取标准工作液(3.2.12.3)中浓度为10/mL的溶液0.5mL,1mL、2mL.5mL10mL于5个100mL容量瓶内，用甲醇定容，该溶液三案氰胺浓度为0.05/mL、0.1μg/mL.0.2μg/mL.0.5μg/mL.1.0μg/mL。4.3仪器和设备
4.3.1气相色谱质谱联用仪。
4.3.2其他同3.3.2~3.3.9。
4.4分析步骤
4.4.1前处理同3.5.1~3.5.2.但带根据洗脱液中三紊氰胺的浓度用甲醇进行适当稀释。4.4.2衍生化
取4.4.1的稀释适量用氮气吹干，加人200uL的吡啶和200的衔生化试剂(4.2.1)，混匀，70℃反应30min。同时，用三案氰胺标准系列(4.2.4)或相应浓度单点标准做同步衍生。4.4.3测定
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4.4.3.1 GC- MS条件
色谱柱：柱长30m，内径0.25mm，甲基苯基案硅氧烷涂层，膜厚0.25m。载气：氧气，流速为1.3mL/min。进样量：1uL
进样口温度：250℃
升温程序;起始温度 75℃,持续 1.0 min,以30℃ / min 升温至 300C,保持 2.0 min。传输线温度：280℃。
运行时间：10.5minc
扫描范围：60m/z~400m/zo
扫播模式：选择离子扫描。监测离子99m/z、171m/z.327m/z.342m/zg离子源温度230℃。
EI源轰击能：70eV。
4.4.3.2测定
定性方法：试样与标准品保留时间的相对偏差不大于0.5%，特征离子丰度与标准品相差不大于20%。
定盘方法：以342,327、171和99蜂面积之和进行单点或多点校正定量。4.5结果计算和衰述
4.5.1 试样中三聚氰胺的含量 X,以质盘分数毫克每干克(mg/kg)表示,单点校正按式(3)计算：X=AxCsxV
式中：
试样溶寇对应的色谱峰面积响应值；三案氰胺标准溶液对应的色谱峰面积响应值；标准工作波中三聚氰胺的浓度,单位为微克每衰升(μg/mL)：用于衍生的试样溶液(4.4.2)体积,单位为毫升(mL);-试样质量,单位为克(g);
稀释倍数。
多点校准时,可用公式(4)：
式中：
-用于衔生的试样溶液(4.4.2)体积,单位为毫升(mL);由标准曲线而得的样液中三案氯胺的含量，单位为微克每毫升（B/mL)：试样量，单位为克(g)：
稀释倍数。
4.5.2平行测定结果用算术平均值表示,结果保留三位有效数字。4.6重复性
在同一实验毫由同一操作人员使用同一仪器完成的两个平行测定的相对偏差不大于20%。
三聚氰胺标准色谱图见图A.1。
附录A
(资料性附录)
三聚氰胺标准图谱
AD1 A,Sig-240,4 Ref-off(070521MEL00302.D)mAU
图A,1三聚鼠胺棕准色图
三案氰胺标准紫外光谱图见图 A.2。DAD),5996(128 mAU,-) of MELAM005.DmAl
图A.2三聚氰胺紫外光谱图
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NY/T 1372—2007
NY/T 1372--2007
A.3三聚氛胺标准品衍生物选择离子色谱图见图A.3。156252
RT:6.06-7.77
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6.586.685.70
TIC F:MS
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7007127237367.39
三聚凱胺标准品衍生物选择离子色谱图A.4
三聚氰胺衍生物选择离子质谱图见图A.4。的的有
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图A.4三聚氰胺行生物选择离于质谱图http:/
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