【农业行业标准(NY)】 饲料添加剂 纤维素酶活力的测定 分光光度法

ICS65.120
中华人民共和国农业行业标准
NY/T912-2004
饲料添加剂
纤维素酶活力的测定
分光光度法
Determination of cellulase activity in feed additives-Spetrothoetricmethod
2005-01-04发布
2005-02-01实施
中华人民共和国农业部发布
本标准的附录八为资料性附录
本标准用中华人民共和国农业部提出前言
NY/T912--2004
本标准用全饲料1业标准化技术委员会归本标准起草单位：中国农业人学农业部饲料工业中心、务兰饲料国际有限公司、广东溢多利生物技术股份有限公司、辽宇众博饲料科技有限公司、北京中农博特生物工程技术有限公司、武汉新华扬：物有限公司
本标准主要起草人：谯化彦、陆义清、刘兴海、李德发、邢建军1范围
饲料添加剂纤维素酶活力的测定分光光度法
本标准规定了用还原糖比色法测定饲料添加剂中纤维素酶的活力NY/T912—2004
本标准适用于饲料添加剂用的饲料酶产品，也适用于含有纤维素酶的添加剂预混合饲料。样品的最低检出量为1.0七/g
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后的所有修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。G/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义
下列术语利定义适用于本标准
纤维素酶活力单位
在37℃.pH为5.5的条件下，每分钟从浓度为4mg/mL的羧甲基纤维素钠溶液中降解释放1umol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位（U）4原理
纤维素酶能将凌甲基纤维素降解成寡糖和单糖。具有还原性未端的寡糖和有还原基团的单糖在溉水浴条件下可以与IDNS试剂发生显色反应，反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中纤维素酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中纤维素酶的活力。
警告：在处理酸、碱和配制DNS试剂时，请戴上保护眼镜和乳胶手套，实验应在通风橱或通风良好的房间进行。一旦皮肤或眼睛接触了上述物质，应及时用大量的水冲洗。5试剂与溶液
除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GI3/T6682中规定的二级水。5.1氢氧化钠溶液，浓度c(NaOH)为200g/L称取氢氧化钠20.0g，加水溶解.定容至100ml5.2乙酸溶液，浓度c(CH,COOH)为0.1mol/L吸取冰乙酸0.60mL，加水溶解，定容至100mL。5.3乙酸钠溶液，浓度c(CH,COONa)为0.1mol/L称取三水乙酸钠1.36g，加水溶解，定容至100ml5.4乙酸一乙酸钠缓冲溶液，浓度c（CHCOOH一CHsCOONa）为0.1mol/LpH为5.51
NY/T912—2004
称取水乙酸钠23.14g，加人冰乙酸1.70ml。再加水解.定容至2(00ml，测定溶液的pH如果pH偏离5.5.再用乙酸溶液（5.2）或乙酸钠溶液（5.3）调节5.55.5葡萄糖溶液，浓度c（C.H/20g）为10.0mg/ml称取无水葡葡糖1.000g，加乙酸一乙酸钠缓冲液（5.4)溶解，定容尘100ml5.6羧甲基纤维素钠溶液，浓度为8.0g/l称取羧甲基纤维素钠（Sigma（5678)0.80g，加人80ml.乙酸一乙酸钠缓冲溶液（5.4）磁力搅拌，同时缓慢加热，直至羧甲基纤维素钠完全溶解（注：在搅拌加热的过程中，川以补加适量的缓冲液，但是溶液的总体积不能超过100ml）。然后.停止加热.继续搅拌30mim.川乙酸一乙酸钠缓冲溶液（5.4）定容至100ml，腋甲基纤维素钠溶液能立即使用，使用前适当摇匀，4℃避光保存，有效期为3d5.7DNS试剂
称取3.5-二硝基水杨酸3.15g（化学纯），加水500ml，搅拌5s，水浴至45℃，然后逐步加人100mL氨氧化钠溶液（5.1），同时不断搅拌，直到溶液清澈透明（注意：在加人氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48℃。）。再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g、苯2.50g和无水业硫酸钠2.50g。继续45℃水浴加热，同时补加水300ml，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。停止加热，冷却至室温后，用水定容至10001n1。用烧结玻璃过滤器过滤，取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。室温下存放7d后可以使用，有效期为6个月
6仪器与设备
6.1实验室用样品粉碎机或碾钵
6.2分样筛
孔径为0.25mm（60月）
6.3分析天平
感量0.001gs
精确至0.01
6.5磁力搅拌器
附加热功能。
6.6电磁振荡器
6.7烧结玻璃过滤器
孔径为0.45umo
6.8离心机下载标准就来标准下载网
3.000r/min
6.9恒温水浴锅
温度控制范围在30℃~60℃之间，精度为0.1℃。6.10秒表
每小时误差不超过55
6.11分光光度计
能检测350nm~800mm的吸光度范围6.12移液器
精度为1
6.13冰箱
7标准曲线的绘制
NY/T912—2004
吸取缓冲液（5.4）+.0ml.，加人1VS试剂（5.7)5.0ml.沸水浴加热5min用自来水冷却至室温用水定容至25.0ml制成标准空样分别吸取菊糖游液（5.5）l.00ml2.00mL、3.00mL、4.00mL5.00ml.6.00ml和7.00ml分别用缓冲液（5.4）定容至100mlL.配制成浓度为0.10mg/ml，~0.70mg/mL葡葡精标准溶液分别吸取上述浓度系列的葡萄糖标准溶液各2.00ml（做2个平行），分别加人到刻度试管中，再分别加人2ml.水和5ml.DVs试剂（5.7），电磁振荡3s，沸水浴加热5min然后，用白来水冷却到室温，再用水定容至25ml：以标准空自样为对照调零，在540nm处测定吸光度OD值。以葡萄糖浓度为Y轴、吸光度（OD值为X轴，绘制标准曲线：每次新配制IDNS试剂均需要重新绘制标准曲线
8试样溶液的制备
固体样品应粉碎或充分碾碎，然后过60H筛（孔径为0.25mm）.按照附录A中建议的称样量称取试样2份，精确至0.001g：加人40mlL乙酸一乙酸钠缓冲溶液（5.4），磁力搅拌30min，再用缓冲溶液（5.4）定容至100mL，在4t条件下避光保存24h。播匀，取出30ml~50ml，上离心机离心3minc吸取5.00ml.1:清液，再用缓冲溶液（5.4）做二次稀释（稀释后的待测酶液中纤维素酶活力最好能控制在0.04U/ml-0.08C/mL之间）
液体样品可以直接用乙酸一乙酸钠缓冲溶液（5.4)进行稀释、定容（稀释后的酶液中纤维素酶活力最好能控制在0.04U/ml~0.08U/ml.之间），如果稀释后酶液的pH偏离5.5，需要用乙酸溶液（5.2)或乙酸钠溶液（5.3）调节校止至5.5，然后再用缓冲溶液（5.4)做适当稀释定容。9测定步骤
吸取10.0ml.羧甲基纤维素钠溶液（5.6），37℃平衡10min吸取10.0ml经过适当稀释的悔液，37℃平衡10mine吸取2.00ml经过适当稀释的酶液（已经过37℃平衡），加人到刻度试管中，再加人5mlDNS试剂（5.7），电磁振荡3$然后加人2.0mL羧甲基纤维系钠溶液（5.6）.37℃保温30min，沸水浴加热5min用白来水冷却至室温，加水定容至25ml，电磁振荡3se以标准空样（参见7）为空白对照，在540mm处测定吸光度AB
吸取2.00ml.经过适当稀释的酶液（已经过37%平衡），加入到刻度试管中，再加入2.0mL羧中基纤维素钠（5.6）（已经过37℃平衡）.电磁振荡3s.37精确保温30mine加人5.0mlDNS试剂（5.7），电磁振荡3s.以终止醇解反应：沸水浴加热5min，用白来水冷却至空温，加水定容至25mL，电磁振荡3s.以标准空白样（参见7）为空白对照，在540nm处测定吸光度As10试样酶活力的计算
试样纤维素酶活力按式（1)式（2)计算_[(Ag-A,)XK/CO]X
武中：
X，一试样稀释液的纤维素酶活力，单位为酶活力单位每笔升（七/ml)：A：—一酶反应液的吸光度；
A，—酶空自样的吸光度；
K一标准曲线的斜率；
NY/T912-2004
（一标准曲线的截！：
M—简葡精的牌尔质量M（O）=180.2g/mol：一酶解反应时间，单位为分钟（nin)：转化内子，1mol=1000mol
X，值应在0.04L/mL-0.08U/ml之间，如果不在这个范围内.应重新选择酶液的稀释度，再进行分析测定
X=X)XD
式中：
X—试样纤维素酶的活力，单位为酶活力单位每克（U/g）：D试样的总稀释倍数。
酶活力的计算值保留3位有效数字11重复性
同一-试样两个平行测定值的相对误差不超过8.0%，二者的平均值为最终的酶活力测定值（保留3位有效数字）。
红维素酶活力，U/g
>2 000
500~200)
200-500
50-200
附录A
（资料性附录）
建议称样量
称样量.g
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