【农业行业标准(NY)】 饲料添加剂 β葡聚糖酶活力的测定 分光光度法

ICS65.120
中华人民共和国农业行业标准
NY/T9112004
饲料添加剂
β-葡聚糖酶活力的测定
分光光度法
Determination of β-glucanase activity in feed additives-Spetrothoetricmethod
2005-01-04发布
2005-02-01实施
中华人民共和国农业部发布bzxz.net
本标准的附求为资料性附录
本标准出中华人民共和租国农业部提出前言
NY/T911—2004
本标准由全国饲料工业标准化技术委员会本标准主要起草单位：中国农业大学农业部饲料工业中心、芬兰饲料国际有限公司、广东溢多利生物技术股份有限公司、辽宁众博饲料科技有限公司、北京中农博特生物工程技术有限公司、武汉新华扬生物有限公司
本标准主要起草人：陆义清、李德发、张丽英、朴香淑、邢建车、刘兴海NY/T 911-:2004
称取，水七酸钠23.14g.加人冰乙酸1.70ml再加水溶解定容至2000ml，测定溶液的pH如果pH偏离5.5.再用乙酸溶液（5.2）或乙酸钠溶液（5.3）调节至5.55.5葡萄糖溶液，浓度c（CgH20）为10.0mg/ml称取无水葡葡糖1.000g.加乙酸一乙酸钠缓冲溶液（5.4)溶解定容至100ml5.6β-葡聚糖溶液，浓度为8.0g/l称取3葡聚糖0.40g、加人乙醇5.0m润湿β-葡聚糖再加人40mL乙酸一乙酸钠缓冲溶液(5.4），磁力搅拌，同时缓慢加热，直至3-葡聚精完全溶解：（注：在搅拌加热的过程中，可以补加适量的缓冲液.是溶液的总体积不能超过50mL，）然后，停止加热，继续搅拌30min，用乙酸一乙酸钠缓冲溶液（5.4)定容至50ml：β-葡聚糖落游液能立即使用.使用前适尚播勾，4℃避光保存，有效期为3d冷冻保存，有效期为2个月（使用前在4℃条件下解冻）5.7DNS试剂
称取3.5-硝基水杨酸3.15g（化学纯），加水500ml.搅拌5s.水浴至45℃然后，遂步加人100mL氢氧化钠溶液（5.1）.同时不断搅拌，直到溶液清澈透明（注意：在加人氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48℃）。再逐步川入水酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.50g和水亚硫酸钠2.50g继续45℃水浴加热，向时补加水300mL不断搅拌，直到加人的物质完全溶解。停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000ml用烧结玻璃过滤器过滤，取滤液，储存在棕色瓶避光保存，室温下存放7d后可以使用，有效期为6个月。
6仪器与设备
6.1实验室用样品粉碎机或碾钵
6.2分样筛
孔径为0.25mm（60H）。
6.3分析天平
感量0.001g
精确至0.01
6.5磁力搅拌器
附加热功能
6.6电磁振荡器
6.7烧结玻璃过滤器
孔径为0.45mm
6.8离心机
3000r/min
6.9恒温水浴锅
温度控制范围在30℃-60之间.精度为0.16.10秒表
每小时误差不超过5s
6.11分光光度计
能检测350mm800mm的吸光度范围6.12移液器
精度为
6.13冰箱
7标准曲线的绘制
NY/T911—2004
吸取乙酸一乙酸钠缓冲溶液（5.4）4.0mL.加人DXS试剂（5.7)5.0mL，沸水浴加热5min用白米水冷却至室温.用水定容至25.0m山，制成标准空自样分别吸取筋翁糖溶液（5.5）l.00ml2.00mL.3.00ml4.00ml.5.00ml、6.00mL和7.00mL分别用缓冲溶液（5.4）定容至100ml配制成浓度为0.10mg/ml0.70mg/ml.葡萄糖标准溶液分别吸取上述浓度系列的葡葡糖标准溶液各2.00mL（做2个平行),分别加入到刻度试管中，再分别加入2.0ml.缓冲液（5.4）和5.0mLDNS试剂（5.7）。电磁振荡3s，沸水浴加热5mine然后，用白来水冷印到室温，再用水定容至25ml以标准空白样为对照调零，在540nm处测定吸光度OD值。以葡萄概浓度为Y轴、吸光度OD)值为X轴，绘制标准曲线。每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线
8试样溶液的制备
固体样品应粉碎或充分碾碎，然后过60日筛（孔径为0.25mm），按照附录A中建议的称样量称取试样2份.精确至0.001g，加人40mL乙酸一乙酸钠缓冲溶液（5.4）。磁力搅拌30min，再用缓冲溶液(5.4）定容至100mL，在4℃条件下避光保存24h，1离心机（6.8）离心3min，取上清液，再用缓冲溶液（5.4）做适当稀释（稀释后的待测酶液中β-葡聚糖酶活力最好能控制在0.04U/mL~0.08U/mL之间）
液体样品可以直接用乙酸一乙酸钠缓冲溶液（5.4）进行稀释、定容（稀释后的酶液中纤维素酶活力最好能控制在0.04L/ml0.08U/mL之问），如果稀释后酶液的pH偏离5.5.需要用乙酸溶液（5.2）或乙酸钠溶液（5.3）调节校正至5.5.然后再用缓冲溶液（5.4）做适当稀释定容。9测定步骤
吸取10.0mLβ-葡聚栅溶液（5.6）.37℃平衡20min。吸取10.0ml经过适当稀释的酶液，37℃平衡10min吸取2.00ml.经过适当稀释的酶液（已经过37℃平衡），加人到刻度试管中，再加人5mLDNS试剂（5.7）.电磁振荡3s。然后加人2.0mlL3葡聚糖溶液（5.6），37℃平衡30min，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，加水定容至25mL，电磁振荡3s以标准空白样（参见7）为空白对照，在540nm处测定吸光度AR
吸取2.00ml经过适当稀释的酶液（已经过37℃平衡）加入到刻度试管中，再加人2.0mLβ-聚糖（5.6）（经过37℃衡），电磁振荡3s.37℃精确保温30min加人5.0mLDNS试剂（5.7），电磁振荡3s，以终止酶解反应：沸水浴加热5min，用门来水冷却至空温，加水定容至25mL，电磁振荡3sa：以标准究门样（参见7）为空对照，在540mm处测定吸光度Ae10试样酶活力按式（1)、式（2)计算X1= (r-AXK+Ca1 1000.
式中：
Xn—试样稀释液的β葡聚糖酶活力，单位为酶活力单位每毫升（L/mL)；Ar：—酶反应液的吸光度：
A—悔空样的吸光度；
标准曲线的斜率；
NY/T911—-2004
（）一标准曲线的截距：
M-葡糖的摩尔质量M(CHO）=180.2g/mol：酶解反应时间，单位为分钟（min)；1000-—转化因子1nmol=1000nolX，值应在0.04l/ml.~0.08U/ml.之间，如果不在这个范围内应重新选择酶液的稀释度，再进行分析测定
X=XpxD,
式中：
X—试样中\β葡聚糖酶的活力，单位为酶活力单位每克(U/g)：D,—试样的稀释倍数。
酶活力的计算值保留3位有效数字11重复性
每个试样应取2份平行样进行分析测定，相对误差不超过8.0%，二者的平均值为最终的酶活力测定值（保留3位有效数字）。
3葡聚糖酶活力.U/g
>2 000)
500-2000
200-500
50-200
附录A
（资料性附录）
建议称样量
称样量.
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