【农业行业标准(NY)】 羊干酪性淋巴结炎诊断技术

ICS11.220
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 908-2004
羊干酪样淋巴结炎诊断技术
Diagnotic technique for caseous lymphadenitis in sheep and goat2005-01-04发布
2005-0201实施
中华人民共和国农业部
本标准的附录人、附录1为规范性附录本标准由中华人民共和国农业部提出前言
本标准出全国动物检疫标准化技术委员会本标准起草单位：西北农林科技大学本标准主要起草人：张彦明、邢福珊。NY/T908-2004
1范围
羊于酪样淋巴结炎诊断技术
NY/T 908—2004
本标准规定广羊/酪样淋巴结炎（caseouslymphadenitisinshecpandgoat，简称（LA）病原菌分离与鉴定和酶联免疫吸附试验2种检疫方法本标准规定的病原菌分离与鉴定适用」羊下酪样淋巴结炎的诊断，酶联免疫吸附试验适用于羊1酪样淋巴结炎的诊断、检疫及流行病学调查2病原菌分离与鉴定
2.1发病特征和病理变化
发病羊的淋巴结肿大，呈脓性十酪性坏死，病羊消瘦，生产性能下降，孕羊产出死胎，严重者死亡，在发病羊的肺、肝、脾和子宫角发生大小不等的结节，内含淡黄色干酪样物质2.2培养基
鲜血琼脂.血清琼脂，葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、H露糖、淀粉、草糖发酵培养基，含0.2%叶温-80的马丁肉汤，成分和制备方法见附录A。2.3病料的采取
按无菌操作方法用18号以上的针头和注射器采取淋巴结中干酪样脓汁，作为病原菌分离与鉴定的病料。
2.4分离培养
2.4.1将采取的脓汁接种于鲜血平板或血清平板.37℃培养24h，观察菌落生长情况2.4.2若在血液琼脂平板上出现黄白色、不透明、凸起、表面无光泽的菌落，初分离时菌落周围有狭窄溶血环，则判为可疑菌落
2.4.3若在血清琼脂半板上出现细小的颗粒样，半透明、边缘不整齐、于燥、松脆的菌落，则为可疑菌落。
2.4.4将上述川疑菌落涂片，用革兰氏染色法染色、镜检。若见有革兰氏阳性、呈球形或细丝状、端或两端膨大呈棒状的细菌，排列不规则，常呈丛状或栅栏状，则为可疑伪结核棒状杆菌，需进一步做生化试验
2.5生化试验
将可疑菌落纯培养后，接种于2.2中的各种糖发酵培养基试管1.37℃培养24h，若葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖发酵产酸不产气，面淀粉、草糖不发酵，则判定为伪结核棒状杆菌3酶联免疫吸附试验(FLISA)
3.1抗原制备
见附录B.1
3.2各种液体的配制
见附录13.2~13.6
3.3酶标抗体和血清
3.3.1酶标兔抗羊IgG
购买酶标免抗羊IgG.用时以稀释缓冲液作1:4000稀释NY/T908—2004
3.3.2阴性血清、阳性血清和待检血清的制备3.3.2.1血清的分离方法
用无菌操作法从羊的颈静脉采取5m血液于洁净的火菌小瓶内，盖上瓶塞，倾斜静置，待析出血清后，用火菌巴氏管将血清吸至另清净的火菌小瓶内，置20%冰箱保存，保存期6个月.用时融解并作1:40稀释
3.3.2.2阴性血清的制备
将临床上健康、伪结核棒状杆菌菌体凝集抑制试验检测结果为阴性的临产前山单当作未受伪结核棒状杆菌感染的羊只.剂腹产后，采其胎羔心脏血液分离的血清作为阴性血清3.3.2.3阳性血清的制备
将伪结核棒状杆菌参考南株（ATCC19410株）人1感染羊，感染羊临床上出现症状，30d后，从肿大的淋巴结中可分离到与感染菌相同的病原菌，采其血液分离的血清作为阳性血清，3.3.2.4待检血清的制备
从随机抽样的待检羊所采血液分离的血清作为待检血清：3.4操作方法
3.4.1在酶标板内加抗原50l./孔（设立2孔空白对照，不加抗原），在4℃冰箱中过夜3.4.2取出酶标板，甩出孔内液体，每孔用洗涤液（本方法中用稀释缓冲液作为洗涤液）200山，甩出孔内液体，反复5次，最后-次甩出孔内液体后在吸水纸上将孔内水分拍于。3.4.3加了抗原的孔加1%BSA50叫L/孔（封闭），置37℃温箱1h，洗涤酶标板（方法同3.4.2）。3.4.4在加了抗原的孔中加血清50uL/孔(2孔阳性血清和2孔阴性血清作对照，其他孔加待检血清各2孔），置37℃温箱1h。洗涤酶标板（方法同3.4.2）3.4.5加酶标免抗羊1g50uL/孔，置37℃温箱1h洗涤酶标板（方法同3.4.2）3.4.6加底物溶液50L/孔，置37℃温箱显色15min，取出，每孔加终止液50L.混勾后用酶标仪测OD492值。
3.5判定方法
用P/N值进行判定。P(Positive)即阳性血清或待检血清平均OD值，V(Negative）即阴性血清平均OD值。若P/N>2.则判为阳性；若P/N≤2，则判为阴性。阳性对照孔P/N值必须大于2，否则试验无效
A,1血液琼脂
A.1.1成分
普通琼脂
无菌抗凝血或脱纤血
A.1.2制备方法
附录A
（规范性附录）
病原菌分离与鉴定培养基的成分和制备方法100 ml.
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A.1.2.1无菌采取健康绵羊须静脉血液，置于盛有玻璃珠的灭菌角瓶或加入灭菌的抗凝剂（5.0g/L柠檬酸钠：血液-1:9或0.1g/.肝素：血液=1:99).按常规方法制成脱纤血或抗凝血。A.1.2.2将普通琼脂温度降至50℃左有按5%-10%的量加人血液，混勾后分装于容器（平皿、试管等）.制成血液琼脂培养基，无菌检验合格后使用A.2血清琼脂
将血液琼脂中的血液成分换作而清即制成血清琼脂A.30.2%吐温-80马丁肉汤
A.3.1成分
猪胃消化液
牛肉浸液
葡萄糖
吐温-80
冰醋酸
醋酸钠
A.3.2制备方法
A.3.2.1猪胃消化液的制备：将新鲜猪胃洗净，去脂绞碎，称取350g.加50℃水1000mL，充分摇匀，再加人盐酸（比重1：19)10ml.充分混合后，置56℃水浴箱中消化24h（在消化过程中每小时搅拌一次）。24h后，可见瓶底只留下很少的红织，消化完毕后，80℃~85℃加热10min，静置并冷却到25t30℃后，虹吸1清液于具塞瓶中，加入1%氯伤充分振荡，然后，置冰箱2℃-8℃保存备用。用时虹吸出上清液，过滤此内容来自标准下载网
A.3.2.2牛肉浸出液的制备：称取切除脂肪、筋腱、肌膜后的牛肉1000g，用绞肉机绞碎或用刀制碎后，放入玻璃容器内，加人蒸馏水1500ml，搅拌均匀，置冰箱内2℃-8℃没泡20h～24h，取出后逐渐加热煮沸1h.不断搅拌。最后补足水分，过滤，分装于玻璃瓶内.121℃高压蒸汽灭菌20min.待冷却后，置2℃-8℃冰箱保存，备用
A.3.2.3将猪胃消化液和牛肉浸液混合.加热至80T时，加冰酷酸1ml，摇匀，煮沸3min~5min，加15%VaH溶液约20ml，调pll至7.2~7.4，继续煮沸3min*5min.加醋酸钠6g，再调pH至7.2~7.4.继续煮沸5min~10min，用滤纸过滤，过滤后补足水至1000ml，再加人葡萄糖10g、吐温-802mlL，摇匀.分装，121高压蒸汽火菌20min.备用3
NY/T908—2004
4糖培养基
A.4.1成分
蛋白豚
1.6%溴甲粉紫酒精溶液
蒸馏水或去离子水
pH调至7.4
注：糖指分析纯或化学纯葡萄糖、半乳糖、甘露糖等A.4.2
制备方法
将上述试剂称量好后，加水搅拌，加热溶解，用0.5mol的NaOH溶液将pH调至7.4，加入指示剂、分装于试管中，115℃高压蒸汽灭菌20min即成。4
B.1抗原制备
附录B
（规范性附录）
酶联免疫吸附试验抗原和试剂的制备方法NY/T908—2004
将参考菌株（AICC19410株）接种于含0.2%叶温-80的马丁肉汤中，37℃振荡培养3d.2000r/mim离心15min，1清液用除菌滤器过滤，滤液即为抗原，用时稀释20倍。B.2包被缓冲液（0.05mol/l.碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液，pH9.6）Na.co
蒸馏水或去离子水
加至1000ml
该液现用现配，临用时以0.5mol/LNa(H将pH调至9.6。B.3稀释缓冲液（0.01mol/L.PBST，pH7.4，也可用作洗涤液）NaaHPO12H
吐温-20
蒸馏水或去离子水
pH调至7.4.
B.4封闭液
加至1000ml
牛血清自蛋白（B3SA）：在生物制品公司购买，临用时作1：100稀释：B.5底物溶液
A液：柠檬酸4.2g溶于200mL水中（0.lmol/L）B液：VaHPO12H.O14.3256g溶于200ml水（0.2mol/L）取A液97.2mL、B液102.8ml.混勾后，加水至400ml，加人邻苯二胺（OPD)0.160g，在暗处操作溶解后分装人小瓶（6mL/瓶），~20%℃避光保存。临用前取出1小瓶融解后加3%H(30=L，即是底物溶液
B.6终止液
将69.5mL浓硫酸（比重1.84）缓慢加入930.5ml.水中.混匀，即是1.25mol/lISO,终止液5
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