【国家标准(GB)】 棉花检疫规程

ICS 65.020.01
中华人民共和国国家标准
GB20817—2006
棉花检疫规程
Ruleforcottonquarantine
2006-12-20发布
数码防伪
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2007-07-01实施
GB20817--2006
1范围
规范性引用文件
术语和定义
检疫要求
检疫准备
输入检疫…
输出检疫
8实验室检疫鉴定
9检疫结果评定及出具证书
附录A（资料性附录）棉花实验室检疫鉴定参考文献
本标准全部技术内容为强制。
本标准的附录A为资料性附录。
本标准由国家质量监督检验检疫总局提出。本标准起草单位：中华人民共和国新疆出入境检验检疫局和新疆农业科学院。本标准主要起草人：薛光华、缪卫国、范伟功、张祥林、莫桂花、刘红军、李宾。GB208172006
1范围
棉花检疫规程
本标准规定了棉花的检疫程序和方法。本标准适用于贸易性或非贸易性棉花（不包括籽棉和脱脂棉）的检疫。2规范性引用文件
GB20817--2006
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB7411棉花原（良）种产地检疫规程3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。3.1
输入检疫importquarantine
进口棉花或由国内地区间调人棉花的检疫。3.2
输出检疫exportquarantine
出口棉花或由国内地区间调出棉花的检疫。3.3
有害生物pest
在棉花生产或储运期间危害的病菌、害虫、杂草等。3.4
quarantinepest
检疫性有害生物
对受威胁地区具有潜在的经济重要性，但尚未在该地区发生，或虽已发生但分布不广并正在被官方控制的有害生物。
检疫批lot
同一国家或地区、同一运输工具装载、同一收货人或发货人、同一品种名称、同一商品规格输入、输出的棉花。
4检疫要求
4.1国内检疫要求
《农业植物检疫对象和应施检疫的植物、植物产品名单》以及各省、自治区、直辖市的《植物检疫实施办法》、《农业植物检疫对象名单（及补充名单）》和《应施检疫的植物、植物产品名单（及补充名单)》中规定的有关棉花生长、贮藏期的检疫对象。4.2进境检疫要求
中国法律法规规定的有关危险性或潜在危险性病虫杂草名录中有关棉花生长、贮藏期的有害生物。中国与有关国家和地区签订的植物检疫双边协定、议定书和备忘录中的有关棉花的有害生物。贸易合1
GB 20817-2006
同、信用证中有关植物检疫条款及要求。4.3出境检疫要求
中国与有关国家和地区签订的植物检疫双边协定、议定书和备忘录中的有关棉花的有害生物。贸易合同、信用证中有关植物检疫条款及要求。5检疫准备
5.1现场检疫用具
样品袋、刀子、钳子、白瓷盘、毛笔、镊子、指形管、采集袋、放大镜、手电筒、铅笔、样品标签等和有关记录表格（单）。
5.2实验室检疫设施
参见附录A。
6输入检疫
6.1现场检疫
6.1.1货证查验
核查货、证是否相符，了解货物的配载、堆放情况，运输工具和包装容器是否承运过农产品或畜产品，棉花是否经过熏蒸处理等。6.1.2堆货场所检查
检查货物堆放场所四周、墙角、地面以及覆盖货物的篷布、铺垫物等，是否有活的有害生物及有害生物感染的痕迹。
6.1.3运输工具和铺垫物检查
登轮、登车、登机及集装箱检疫时，检查船舱、车体、机体及箱体的缝隙、梁搁、边角，以及铺垫物、动植物性残留物有无有害生物或有害生物活动的痕迹。6.1.4包装物检查
开舱或开箱，检查货垛表面上层、侧面和棉花的外包装，是否有活的有害生物或有害生物感染痕迹，是否粘有土壤、杂草，是否有霉变、动物户体等。6.1.5货物检查
6.1.5.1剪开包头布，检查包布内外壁和棉花表层，有无活的有害生物及为害痕迹，如虫粪、蜕皮等；检查棉花中是否混有棉籽、棉籽壳、杂草籽以及其他植物残体6.1.5.2按6.2的要求对棉花进行抽检和取样，表层棉花检疫未发现有害生物的，继续对中下层装载的或集装箱里层的棉花进行检疫。6.1.6截获物的收集
将现场采集截获的害虫、杂草籽、植物残体、土壤、棉籽、棉籽壳等装人指形管或采集袋中，并放入标签，与棉花样品一同送实验室检疫鉴定。6.1.7现场检疫记录
按照现场查验的顺序，记录检疫中所发现的情况，填写现场检疫记录单。6.2抽检与取样
6.2.1抽检方法
6.2.1.1每批按总件数的3%~10%抽检。6.2.1.2选择有害生物易藏的部位和随机抽检相结合，开包抽检时着重挑选带棉籽（壳）和夹有杂草籽、植物残体的棉花。
6.2.1.3实施堆垛抽检时，在堆垛上、中、下层按对角线、棋盘式或随机取样的方法抽取代表样品。6.2.1.4对船舱、机舱、车厢、集装箱装载的棉花，分别按6.2.1.3抽取代表样品。2
6.2.2取样
以每个检疫批为单位，从抽检抽出的棉花中取样。GB20817—2006
每批总件数在50包以下取1份样品，50包～100包取2份样品，101包～200包取3份样品，陆运、空运集装箱运每增加100包递增1份样品；海运（整船散装）每增加500包递增1份样品。每份原始样品2.0kg~2.5kg。
7输出检疫
7.1田间检疫调查
7.1.1在棉花生长期间，对棉花主要病、虫、杂草的发生和防治情况进行调查（见GB7411)。7.1.2田间检疫记录。
7.2加工过程检疫
7.2.1检查棉花的生产加工工艺设施及流程。7.2.2厂区及厂周围不应有其他农产品、畜产品堆放；加工厂里不应有易感染仓储害虫的杂物；已加工的棉花与原料、半成品应分开堆放；经加工尚未打包的棉花，不得带有活的有害生物及土壤、棉籽（壳）、植物残片等；解剖棉籽，检查内部有无害虫。7.2.3必要时抽取样品和有害生物一同送实验室检疫鉴定。7.2.4加工过程检疫记录。内容有：棉花来源，加工厂的位置、环境条件和卫生状况，加工能力，棉花中携带有棉籽(壳)和植物残体的比率和有害生物发生情况。7.3仓储库区检疫
7.3.1仓储库区内不应有农产品、畜产品及易感染仓储害虫杂物的堆放；库内墙壁、墙脚、墙角、窗台等地方不应有害虫的痕迹：棉包包装外表及铺垫物不应有活的害虫和土壤。7.3.2根据需要随机抽检棉包，检查包布内外壁和棉花表层有无活的害虫及其害虫活动痕迹，有无附着棉籽（壳）、植物残片等；对棉籽解剖检查内部有无害虫。7.3.3抽取样品送实验室检疫鉴定。7.3.4仓储库区检疫记录，同7.2.4。7.4现场检疫
7.4.1货主报检前，输出棉花应集中堆放，检疫人员受理报检后，审核单证及7.1或7.2或7.3的检疫记录。
7.4.2按6.1实施检疫。
7.4.3根据6.2要求抽检和取样。7.4.4发现检疫问题，抽取样品或截获物送实验室检疫鉴定。7.4.5现场检疫记录，同6.1.7。7.5离境检疫或调出检疫
7.5.1检查棉包外包装是否感染有害生物，注意外包装及缝隙有无害虫藏匿。7.5.2发现外包装有有害生物及有害生物为害痕迹，开包检查，检疫方法同6.1。7.5.3抽检和取样同6.2。
7.5.4检疫记录同6.1.7。
8实验室检疫鉴定
实验室检疫鉴定参见附录A。
GB208172006
9检疫结果评定及出具证书
9.1结果评定
9.1.1根据现场检疫、加工过程检疫和实验室检疫鉴定结果，对照有关检疫要求（参见第4章），符合的评定为检疫合格。对不符合有关检疫要求的，判定为不合格。9.1.2对不符合有关检疫要求，有有效处理方法的，经除害处理并检疫合格后，准予输入或输出；无有效处理办法的退回，不得输人或输出。9.2出具证书免费标准bzxz.net
9.2.1输出检疫
9.2.1.1国内地区间输出棉花出具《植物检疫证书》（省间）。9.2.1.2出口棉花出具《植物检疫证书》格式C5-1)。9.2.1.3对输入国家或地区要求出具熏蒸证书的，经熏蒸除害处理合格后，出具《植物检疫证书》（格式C5-1)和《熏蒸/消毒证书》(格式C7-1)。9.2.2输入检疫
9.2.2.1.进口棉花出具《人境货物检验检疫证明》（格式5-1)。国内地区间输入棉花，出具《植物检疫证书》（省间）。9.2.2.2
A.1实验室要求
附录A
（资料性附录）
棉花实验室检疫鉴定
GB20817—2006
真菌、细菌、病毒分离、培养设备（温箱、培养箱），昆虫养殖、鉴定设备（显微镜），杂草培养、鉴定设备及资料等。
A.2制备棉样
将现场检疫扦取的棉样采用四分法取两份平均样品，一份供试验用，另一份留存备查。A.3鉴定
仔细检查棉样中有无害虫、杂草籽及棉籽（壳），连同现场检疫中采集的害虫、棉籽（壳）、植物残体、杂草籽，分别送有关实验室检疫鉴定。A.3.1昆虫检疫鉴定
A.3.1.1谷斑皮鑫的检疫鉴定参照GB/T18087—2000《植物检疫谷斑皮鑫检疫鉴定方法》。A.3.1.2墨西哥棉铃象的检疫鉴定参照SN/T1264-—2003《墨西哥棉铃象鉴定方法》。A.3.1.3其他的昆虫检疫鉴定参照相关昆虫方面的专业资料。A.3.2杂草检疫鉴定
A.3.2.1列当的检疫鉴定参照SN/T1144—2004《植物检疫列当的检疫鉴定方法》。
A.3.2.2范丝子的检疫鉴定参照SN/T1385—2004《范丝子属的检疫鉴定方法》。A.3.2.3其他的杂草检疫鉴定参照相关植物方面的专业资料。A.3.3植物病原物检疫鉴定
A.3.3.1真菌鉴定
A.3.3.1.1棉花主要病原菌检测用培养基棉花枯萎病菌：采用植选1号或PDA培养基。棉花黄萎病菌：采用棉选1号或D培养基。1
棉花黑根腐病菌：采用TBCEN培养基和参照SN/T1356—2004《棉花根腐病菌检疫鉴定方法》。A,3.3.1.2制备培养基
A.3.3.1.2.1TBCEN配方
第一步
琼脂(粉)
蒸馏水
第二步
冷却到50℃，依次加人下列药品：碳酸钙（CaCO,）
浓盐酸(Conc.HCI）
青霉索（penicilliumG）
硫酸链素（streptomycinsulfate）12 g
GB20817-—2006
第三步
加灭菌水约5mL
盐酸氯四环素（chlortetracyclineHCI)（加200g/L的氢氧化钠2滴）再加人：制舞菌素（nystatin）250000混匀后加人培养基中
第四步
氯唑灵（terrazole）
第五步
削皮的新鲜胡萝卜汁
A.3.3.1.2.2植选1号配方
以蛋白陈为氮源，蔗糖为碳源，再加上磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钾等无机盐类，以五氯硝基苯、偏重亚硫酸钾抑制其他一些真菌的生长，但对尖孢镶刀菌则不抑制，以链霉素抑制细菌，以甲基纤维素促进大型分生孢子的生长。
成分：
甲基纤维素（CMC)
蛋白陈
磷酸二氢钾
硫酸镁
硝酸铵
氯化钾
偏重亚硫酸钾
五氯硝基苯（PCNB)
蒸馏水
链舞素
1000mL
100000U
注：甲基纤维素（CMC）及链每素、制每素均在灭菌后加人。制霉素不加也可，气温高菌多时要加人。A.3.3.1.2.3棉选1号配方
成分：
硝酸钠
磷酸二氢钾
氯化钾
氯霉素
五氯硝基苯（PCNB)
克菌丹
350mg/L
硫酸镁
硫酸铁
蒸馏水
井冈霉素
1000mL
2. 5 mg/L
注1：井冈霉素、五氯硝基苯(PCNB)、克菌丹灭菌后加人。注2：2.5g土样加人200mL含1%多聚磷酸钠及0.01%王基酚聚氧乙烯醚（tergitol-NPX）的水溶液内，8000r/min搅拌15min。
A.3.3.1.2.4D培养基配方
成分：
土壤浸提液
磷酸二氢钾
半乳糖醛酸钠
Dox盐
五氮硝基苯(PCNB)
磷酸氢二钾
尿酸钠
山梨糖
王基酚聚氧乙烯醚（tergitolNP-1o)琼脂
蒸馏水
pH-6.4~6.7
1000mL
GB20817—2006
注1：土填浸提液的制备：用肥沃菜园土1kg，置于2L容器的三角瓶中，加蒸馏水1000mL，在沸水中浸提1h，再经多次过滤、澄清后定容为1000mL，置4℃下保存备用。注2：Dox盐：含磷酸二氢钾2g;氯化钾2g；硫酸镁1g；硫酸铁0.02g；硝酸钠4g；蒸馏水20mL。注3：培养基灭菌前加人五氯硝基苯（PCNB），经121℃高压灭菌30min。待培养基融化后，温度降至45℃时，每1000mL融化培养基加抗菌素液50mL(含氯霉素0.05g，链帮素0.05g，青霉素-G盐0.05g)，充分混匀后，每倒人培养基15mL。
A.3.3.1.3分离鉴定
A.3.3.1.3.1棉籽（壳)病原菌分离鉴定洗涤镜检将棉籽（壳）若干，装人三角瓶里，加灭菌水，振荡5min～10min，将三角瓶中的浑水分装于离心管里，3000r/min离心5min，弃上清液，取沉淀物，制片在显微镜下镜检。培养鉴定取棉籽（壳）若干，装人一个纱网袋子里，用自来水冲洗12h～24h，再在0.1%升汞液里消毒2min～3min，用无菌水清洗三遍后，用镊子夹取棉籽（壳）放人培养基中，每皿5粒～6粒，25℃左右恒温箱中培养3d～4d，将形成的菌落移至PSA斜面试管中，25℃培养3d～4d，制片镜检，根据病菌形态及培养特性鉴定其种类。A.3.3.1.3.2棉纤维、植株残体上的病原菌的分离鉴定洗涤镜检将待检的棉纤维样1g，分成三份，分别置于含有100mL无菌水的三角瓶中，充分润湿样品后，将三角瓶置于恒温摇床器上，120r/min振荡培养24h后，3000r/min离心5min~10min，弃上清液，取沉淀物，制片镜检。培养鉴定将待检的棉纤维样1g，剪成约1mm长，分别置于6个直径为9cm无菌培养血中；轻轻倒人42℃～45℃的相应的选择性培养基8mL～10mL于培养血中，使棉纤维均匀分布；待培养基凝固后，再倒入42℃45℃的同一种培养基15mL～20mL，将棉纤维、植株残体埋人培养基中；将其置人25℃恒温培养箱中培养7d，进行菌落观察和镜检，根据病菌形态及培养特性鉴定其种类。A.3.3.2细菌鉴定
A.3.3.2.1称取50g棉籽加到盛有100mL预冷（5℃）)的无菌生理盐水(0.85%NaCI)的三角瓶中。缓慢摇动三角瓶以浸没所有棉籽。将其置于黑暗中5℃下孵育18h左右。A.3.3.2.2加人0.05mL灭菌的吐温20，振荡1min。A.3.3.2.3将悬浮液经灭菌的双层纱布过滤到无菌离心管中。A.3.3.2.48000g离心15min，弃上清液，用10mL生理盐水悬浮沉淀。A,3.3.2.5将沉淀悬浮液系列稀释10-2，10-3，10-，10-5。每个稀释度取0.1mL涂布在MOPS选择性培养基平m上，重复3次。将平皿置于28℃恒温培养箱中培养3d。A.3.3.2.6棉花细菌性角斑病菌在MOPS选择性培养基上形成黄色的菌落。在进行致病性测定之前，将可疑菌落进行单菌落纯化。A.3.3.2.7致病性测定。将所有怀疑是棉花细菌性角斑病菌的分离物在2片～5片真叶期的棉花幼苗上进行致病性检测。操作方法如下：A.3.3.2.7.1将培养36h的细菌分离物配制成10°CFU/mL的细菌悬浮液，喷雾到供试棉花幼苗的叶片上直到有水滴从叶片上滴下。每个分离物至少接种五株幼苗，以喷水的植株做对照。将接种的幼苗置于高湿及25℃～30℃的环境中生长8d~15d，观察植株发病情况。幼苗受棉花细菌性角斑病菌侵染后，在子叶上表现为圆形或椭圆形油浸状暗绿色小病斑，以后病斑逐渐扩大，并变为褐色或深揭色，真叶上的病斑扩展因受叶脉限制而呈多角形，病斑为褐色油浸状，一般1mm～4mm大小，严重时很多病斑连成片。
A.3.3.2.7.2从发病植株上再次分离病菌，并进行快速鉴定，以确定其为Xanthomonascampestris7
GB20817—2006
pv.maluacearum (Smith) Dye。A.3.3.2.8MOPS选择性培养基的配方：50%甘油
琼脂(粉)
高压灭菌后，冷却至50℃时加人以下样品：加100mL灭菌的10倍MOPS贮存液。加5mL灭菌的7种氨基酸200倍贮存液。30%磷酸氢二钾（K，HPO.）
蒸馏水
加适量的抗生素（如：25mg/mL卡那霉素Kan351.4mL）。母液1:MOPS10倍贮存液
MOPS(MW209.3)...
N-三(羟甲基）甲基甘氨酸（tricine,MW179.2)..硫酸铁（FeSO.·7H,OMW278.0)
氯化铵（NHCI，MW53.5）…
硫酸钾（K,SO.，MW174.3）
氯化镁（MgClz，6HzO（MW203.3）溴化钾（KBr，MW119.0）
氯化钙（CaCl，·2H.0，MW147.0,1mmol/L）..微量元素（见母液2）…
：10mL（105倍贮存液）
溶解于900mL蒸馏水中，用NaOH调节pH至7.4，然后定容至1000mL。过滤灭菌，4℃下存放。
注：MW-
分子量。
母液2：105倍的微量元素贮存液钼酸铵（(NH)。Mo,O2·4HzO,MW1235.9)氯化钻（CoCl，·6HzO.MW237.9）硫酸铜（CuSO,·5H,O，MW249.7)..硫酸锌（ZnSO,·7H,O,MW287.9）.氯化锰（MnCl,·4HzO,MW197.9）将上述微量元素配制成105倍的贮存液，过滤灭菌，20℃下存放。母液3：200倍的7种氨基酸贮存液.0.03 mol/L
..0.3mol/L
. 0.1 mol/L
... 0.1 mol/L
.0.8mol/L
丙氨酸(alanine，Mw89.0）....o.84g精氨酸(arginine.HCl,Mw210.7)...2.53g组氨酸（histidine·HCl，MW209.6)天门冬酰胺（asparagine·H,0，MW150.1)0.85g
异亮氨酸（isoleucine，MW131.2）0.79g
苏氨酸(threonine.MW119.1).....71g....42g.
苯丙氨酸（phenylalanine，MW165.2)0.99g
溶解于90mL蒸馏水中，然后定容至100mL。过滤灭菌，20℃下存放。A.3.3.3病毒监定
A.3.3.3.1核酸提取
A.3.3.3.1.1称取待测棉籽5g，置于研钵中，加液氮研磨成细粉状。A.3.3.3.1.2称取100mg样品加人到2mL的离心管中，加人1000μLCTAB提取液和2μLRNase酶溶液，充分混匀，65℃孵育30min，不时振荡。A.3.3.3.1.312000r/min室温离心5min，将上清液转移至另一干净的2mL离心管中；加人等体积8
24：1三氯甲烷/异戊醇，轻缓颠倒数次后室温静止5min。GB20817—2006
A.3.3.3.1.412000r/min室温离心10min，将上清液转移至另一干净的1.5mL离心管中；加人等体积的CTAB沉淀液，轻缓颠倒混勾后室温静止1h。A.3.3.3.1.512000r/min室温离心5min，弃上清液，加入400μL1mol/LNaCl溶解沉淀，56℃孵育15min。
A.3.3.3.1.6加人800μL经-20℃预冷的无水乙醇，颠倒混匀后-70℃静止30min或一20℃静止1h。
A.3.3.3.1.715000r/min室温离心10min，弃上清，70%乙醇洗涤沉淀2次～3次，干燥DNA。A.3.3.3.1.8加50μLTE缓冲液溶解沉淀，4℃冰箱保存备用。A.3.3.3.2PCR检测
A.3.3.3.2.1引物序列：可选用以下引物进行PCR扩增。CL-CR 正: 5'-CCC TGA ATG TTY GGA TGG AA-3*CL-CR反：5-CGGGCGTAGAAATGACGAT-3A.3.3.3.2.2PCR反应体系
10XPCRBuffer
25mmol/LMgClz
2. 5 mmol/L dNTP
20pmol/μL引物正
20pmol/μL引物反
1U/μLTaq酶
DNA模板
双蒸水
A.3.3.3.3PCR反应条件
94℃/5min，94℃/30s，55℃/40s，72℃/60s，40个循环，72℃/3min，4℃保存。A.3.3.3.4PCR产物的凝胶电泳检测制备1.5%的琼脂糖凝胶，按比例混勾上样缓冲液和PCR扩增产物，然后将其加人样品孔中，并用100bp的DNAMarker做分子标记，进行电泳分析。电泳结束后，在凝胶成像仪的紫外透射光下观察是否扩增出预期的特异性DNA电泳带，拍摄并做好记录。A.4室内检疫记录
填写室内检疫记录单，对截获的病原菌、害虫、杂草的鉴定结果要填写结果报告单，检疫性有害生物或首次截获的有害生物必须经专家鉴定或复核。A.5截获物的保存
将已经鉴定的病、虫、杂草制成标本，按照各自的保存方法妥善保存。
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