【国家标准(GB)】 食品卫生微生物学检验 沙门氏菌检验

ICS 07. 100. 30
中华人民共和国国家标准
GB/T 4789.42008
代替GB/T4789.4—2003
食品卫生微生物学检验
沙门氏菌检验
Microbiological examination or lood hygiene-Examination of Satmonella
2008-05-16发布
中华人民共和国卫生部
中国国家标准化管理委员会
2008-11-01实施
GB/T 4789.4—2008
标准参考采用了围际分析家学会（AOACINTERNATIONAL）AOACOffirialMcthad967.26，967.27,967.28：国际标推化组织（ISO)JSO6579:2002；美国食品药品管理局（FDA)《细菌分析手册》第5 :秒门氏菌(2003 年)(Bacteriological Analytical Manual,Chapter 5,Saimanetta,2003),本标推代替（G13/T1789.4--2003《食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验》，本标滩白实施之口起，（13/T4789.1-2003同时废止。本标准与GB/T4789.4—2003相比上要变化如下规范了祥品制备过程；
修改「原标摊中前增茵和增菌部分；…修改了原标游中分离部分;
修改了原标准中生化试验部分。本标雅的附录 A、附录B为规范性附录。本标准中华人民共和国牛部提出并归可。本标准负责起毕单位：中国疾病预防控制中心营养与食品安全所，本标雅参加起草单位：吉林脊疾病预防控制中心河南省疾蛎预防控制中心广西壮族白治区疾预防控制中心、福建省疾病预防控制中心、渐江省疾病预防控制中心。本标准士要起节人：刘秀梅、郭云昌、刘桂华、李秀佳、廖兴广，马群飞、程苏云，田静，本标雄所代替标雅的历次版本发布情说为：GB 4789.41984,GI3/T 1789.41994,GB/T 1789.42003.1范围
食品卫生微生物学检验
沙门氏菌检验
本标准规定了食品中沙门氏菌的检验方法。本标准适用二各类食品和食物中毒样品中沙门氏菌的检验。2设备和材料
险微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下，2. 1 冰箱:2℃~-5℃。
2.2忆温培养箱:36℃±1℃,42℃±1℃7.3均质器。
2.4振葱器
2.5电子犬平：感鼠0.1。
2.6无菌形瓶：容量500ml.,250mLGB/T 4789.4—2008
2.7无菌吸：1mJ（具0.01.刻度）、0mL（具0.1nL刻度）或微量移液器及吸头。2.8无菌培养厂.:直径90mm，
2.9无菌试管：3mm×50mm.10mm×75mm2.10无菌毛细管。
pH计或pH比色管或精密pH试纸
全白动微生物鉴定系统（VITEK)\。3培养基和试剂
缓冲蛋白陈水(BPW)：见第 A.1章，3.1
四硫磺酸钠煌续(TTB)增菌液:见第 A.2 章。3.2
亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液：见第A.3章：3. 4亚硫酸铋(BS)琼脂;见第 A, 4 章3. 5 HE(IIcktocn Entcric )琼脂见第 A. 5章。3.6木糖赖氨酸脱氧胆盐(XIL.I))琼脂：沈第A.6章。3.7科玛嘉沙门氏菌属显色培养基”。3.8
三糖铁(TSI)琼胎:见第 A.7。
3. 9蛋白陈水、基质试剂:见第 A.8章。3.10尿素琼脂p17.2):见第A.9章。鼠化钾（KCN）培养基:见第A.10 章。3.11
赖氨酸脱羧酶试验培养基:见第 A.11章。由法国上物梅单埃公司提供的产品的兹昂名。给出这信息足为了方便本标差的使用者,并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则使川这些等效的产品。由法国科玛嘉公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使并，并不裁示对该产品的认2
可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。1
GB/T 4/89.4—2008
糖发酵管:见第 A,12章。
邻硝基酚9D半乳糖背（ONPG)培养苯：见第A.13章3.15半固体琼胎：见第A.14章。3.16丙一酸钠培养基：见第A,15章，沙门氏荫 O 和 H 诊断血清。
3.18API20E生化鉴定试剂盒或VITEKGNI+生化鉴定卡1）检验程序
沙门氏菌检验程序见图1。
bg（mi）样品+225nLBPW
36℃1℃
8h~18h
1ml+TB10ml
IRh-~24h
C,405·-48
mL+SC10mL
3611u. 18 h~24h
XLD（或HE、科玛鑫业色培养基）36c±1c1H~24h
姚取可爱菌落
TSI,赖氨酸，营养琼脂(NA)
商品化生化
鉴定系统
星素-KC
基质、保素（p117-2)，家化钾（CN）HiS+能站底+
深素-KEN-
极氨酸
甘器酸+、山梨醇+
沙门氏菌，血清毕试验
图1沙门氏菌检验程序
HaS-低质-
原乖KCN-
换氨酸+
反应结果与左
侧描逆不
非沙门氏荫
5操作步骤
5.1前增菌bZxz.net
GB/T4789.4—2008
称聆25 g(mL)样品效人盛有 225 InL BPw 的无菌坞质杯中,以 8 000 /min-~10 000 1/min 均质1 min-~2 min,或置于盛有 225 mL BPW 的无卤均质袋中,用拍击式为质器拍打 1 min-~2 min。若样品为液态,不需要均质,振荡混勾：如需要，测定 pHI值，用1 mol/ml 无菌氮化钠或盐酸调 pH至6.8±0.2，尤菌操作将样品转至500ml.锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于36℃一1℃培养8 h-~18 h.
如为冷冻品,应作 15℃以 下不趋过 15 min,或 2r-5℃不超过 18 h解冻。5.2增菌
轻轻摇动培养过的样品混合物,移取i ml.,转称丁 10 rnl.TrB 内，于42℃一1℃ 培养 18 h～21 h。同时，另取1m，转种10nS内，于36℃i℃培养18h～24.5.3分离
分别用接和环取增菌液1环，划线接种于-个BS琼脂平-板和个XLD琼脂平板（或HE坏胎平极戴科玛靠显径培养基平板），-36C上1℃分别培推18h21h（X1D琼脂平板IIE琼脂平板,科玛嘉显免培养猪平板）或40h一48h（S琼脂平板，观客个平板上生长的菌落，客个乎板上的菌落特征见表1，
表1沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征选择性琼脂平板
TS琼脂
HE琼脂
XLD 晾脂
科玛嘉整在培养甚
5.4生化试验
沙门氏菌
谢游为熙色有金属光、棕褐色或灰色，战落周围培养基可旦黑色或棕色;有些菌株形成灰缘色的菌落，周巢培养基不变
蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或儿至全黑色；有些菌株为黄他，中心黑危或几子全熙色
菌落呈粉红色，带惑不节熙色中心有些菌株可星现大的带光洋的黑色中心惑是现全部恩色的菌落;有些菌株为黄色菌荫落,带或不带黑色中心菌落为紫红色
5.4.1白选择性琼猎平板「分别挑取两个以「典型或可疑菌落，接种三糖默琼脂,先在斜面划线,再于底层穿刺;接种针不要灭菌，直接接种赖氨酸脱浚试验培养基和养琼脂平板，丁-36C上1℃培养1811-24 h，必要时可延长至48h，在三铁琼脂和赖氨酸脱羧试验培养基内，沙门见菊的反应结果见表2。
表 2沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果三糖铁琼脂
硫化氢
赖氨酸说羧酶试验培养基
注：十阳性，一阴性；十（一）多数阳性，少数阴性；十/一南性或阴性。初步判断
可疑沙门氏茵属
可莎门氏菌属
可薪沙门氏菌属
非汐沙门氏菌
GB/T 4789.4—2008
表2说明，在三铁琼胎内斜面产酸，底层产酸，问吋赖氮酸脱羧酶试验阴性的菌棕可以排除。其他的反成结累均有沙门恶菌属的叫可能，同时也均有不是沙门菌属的可能，5.4.2接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧试验培养基的同时,可直接接种蛋白陈水（供做靛基质试验）、尿素琼脂（pII7.2）、氰化钾（KCN）培养基，也可在初步判断结果后从营养琼胎平板上挑取可疑菌落按种。丁36℃士1'C培养18 h~-24 h，必要时可延长至 48 h，按表 3判定结果。将已挑菌落的乎板储存于2℃~5℃或室温至少保留24h，以备必要时复查，表3沙门氏菌属生化反应初步鉴别表反应序号
注：十陆性；一阴性，
友应序号
靛基质
性或朗性
pH7.2尿素
1典型反应别定为沙门氏菌属
氰化钾
顺氨酸脱羧酶
如尿素、氰化钾和赖氨酸脱羧酶3项巾有1项异常，按表4可判定为市民菌。如有2项异常为非沙门氏菌。表4
PII7.2录
（KCN)
注：十表示阳性6示阴性。
沙门氏菌属生化反应初步鉴别表羧氨酸
脱胶酶
甲型副伤寒沙门氏菌（要求血清学鉴定约果沙门氏离N或V（要求符合本群生化特作）沙间氏徽个别变体（婴求血清学鉴定结是）5.4.2.2反应序号42
补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定
5.4.2.3反应序号A
果进行判定
做ONPG
ONPG阴性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱羧酶阳性，甲型刷伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱酶阴道
5.4.2.4必发时按表5进行少门氏菌生化群的鉴别。责5沙门氏菌属各生化群的鉴别
卫茅醇
山缨醇
水杨古
内二酸盐
氧化钾(KCN）
注，十表示阳性；：
裴示阴性。
5.4.3如选择API20E生化鉴定诚剂盒或VITEK金自动微牛物鉴定系统，可根锯5.4.2的初步判断结果，从营养琼脂平板上挑取可疑菌落,用生现盐水制备成浊度适当的菌悬液，使用API20F生化鉴定试剂盒或 VITEK 全自动微生物鉴定系统进行鉴定,4
5.5血清学鉴定
5.5.1抗原的准备
一般采用1.2%~1.5为脂培养物作为坡片凝集试验用的抗原。GB/T 4789.4—2008
0血清不凝集时，将菌秩接种在琼脂最较高的（如2%～3%）培养基上再检查，如果是用于Vi抗原的存在而阳止了凝集反应时，可挑瑕菌苔于1ml.生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查，H抗原发育不良时，将菌株接种在0.5%～0.65%半固体琼脂平板的中央，候菊落蔓延牛长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过装有0.3%～-0.2%辛固体琼脂的小玻管1次～2次，自远端驳荫培养后冉捡查。
5.5.2多价菌体抗原（0)鉴定
在玻片上划马两-个约1cm×2 c的区域,挑取1坏待测菌,各放 1/2环于玻片上的每一区域上部，在其中·个区域下部加1滴多价菌体(0)抗血清,在另一区域下部加人1滴生理盘水，作为对照，再用无菌的接种环或针分别将两个区威内的菌落研成乳.状液，将玻片倾斜摇动混合1[nin,并对差黑暗背景进行观察何程度的凝集现象皆为性反应。5.5.3多价鞭毛抗原（H)鉴定
同5.5.2。
5.5.4血清学分型（选做项目）
5.5.4.10抗原的鉴定
用A～F多价血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照，在生理盐水中自凝者为粗糙形菌株，不能分型。
被A～F多价0血清凝集名，依次用04；03、010；07；08；09；02和011因子血清做凝集试验，根据试验结果，判定0群。被03,010血凝集的菌株，再用010,015,031,019单因子工清做凝集试验，判定E1、E2、E3.E4各亚群，每一个0抗原成分的最后确定均应根据0单因子血清的检查结果，没有0单因子血清的要用两个0复合因了工清进行核对，不被A~-F多价0血清凝集者，先用9种多价血检查，如有其中一种血清凝集，则用这种上清所包括的○群血清逐一检查，以确定○群，每种多价血清所包括的（因于如下：O多价）A，,C,D，E，F（并括,14群）0多价213，16，17，18，21群
0多价328，30，35，38，39群
0客价410，41，12，43群
0多价544.5，47,48群
0多价650，5152，53群
0多价755,56,57，58群
0多价859.60,61,62群
0家价963，65，66，67群
5.5.4.2H抗原的鉴定
肩于 A-~F各 O 群的常则菌型，依次用表 6 所述 H 因子血清检交第 1 相和第 2 相的 H 抗原。表 6A～F群常见菌型H抗原表
笃1租
第2利
GB/T 4789.4—2008
不气的
D(产气的)
表6(续）
第1相
k,v,r,c
第2柜
不常见的菊型，先用8种多价血清检查，有其中一种或两种血清凝集，则再用这一种或两种，血清所位括的各种 H 因-}-iL清逐 -检查，以第 1 相和第 2 项的 H抗原。8 种多价 H 血清所包括的 II因了如下：
H多价！a,b,c,d,i
H多f2eh,ex,euziggnis,gfugp,gsit,gH多价3k,r,y,z,z1a,lv,w,lz3,l22s,lzaoH多价41,21,5;1,6,1,7;z
H多价5z42z224z222952375
I1客价6Z21+uZ4
H多价7 232 5235254+235
H价82557，Z:751，262
年个 抗原成分的最后确定均应根据 H 单因了血清的检查结果，没有 H单因『血消的要用两个让复合因子血清逊行核对。
检出第「析 H抗原而未检出第2相 H抗原的或检出第 2 相 H抗原而米检出第1相 H抗原的,可在琼脂斜而1移神1代～2代后再检查。划仍只检出个朴的H抗原，要用位相变异的方法检查其刃个相。单相菌不必做位相变异检查。位相变异试验方法如下：
小豉管法：将半固体管（每管约1nL～2mL）在酒精灯上熔化并冷笔50℃，取已知相的I1圆子iL消.0L-0.1mL，加人于熔化的半固体内，混勾后，用毛细吸管吸取分裴于供位机变异试验的小玻内，侯凝固厉，用接种针挑取待检菌，接种于一端。将小玻管平放在平Ⅲ内，并在其旁放一团湿棉花，以防琼脂中水分蒸发崩缩，每大检查结果，待另一柏细菌解离后，可以从另－端挑细函进行梳查，培养基内血清的浓度应有适当的比例，过高时细菌不能生长，过低时同相细菌的对力不能抑制。一般接原血清1：200~-1：800的量加人。小倒管法：将两端开口的小玻管（下端开了要留一个缺口，不耍半齐）放在半固体管内，小玻管的上端应高出于培养基的裘面，灭菊后备用。临用时在精灯上加热熔化，冷至50℃，挑聪因子血清1环，加人小套管中的华固体内，略加搅动，使其混匀，侯凝固后，将待检菌株接种于小套管巾的半舌体表层内，排天检查结架，待另-州细菌解离后：可从套臂外的半固体表面取菌检查，或转种1%软琼指斜面，于37℃培养后再做凝集试验。简易乎板法：将0.7%～0.8%半固体琼胎板烘干表面水分，挑取因子血消1坏，滴在半体平板表面，放置片刻，待血清吸收到琼脂内，在而血清部位的中央点种待检菌株，培养后，在形成蔓延生长的菌苷近缘收菊检查。
5.5.4.3vi抗原的鉴定
GB/T 4789.4--2008
用Vi因子血清检查。已知具有Vi抗原的菌有：伤寒沙门氏菌，丙型副伤寒沙门氏菌，都柘林沙门氏菌。
菌型的判定
根血清学分型鉴定的结桌，按照附录B或有关沙门氏菌属抗原表判定菌型。5.6结果报告
综合以上生化试验和血清学鉴定的结呆，报告25 g样品中检出或未检出沙门低荫属：GB/I 4789.4—2008
A.1缓冲蛋白陈水(BPW)
A. 1. 1 成分
蛋白陈
氯化钠
磷酸氢二钠(含12个结晶水)
磷酸二氢钾
蒸馏水
A.1.2制备
附录A
（规范性附录）
培养基和试剂
1 000.0 iml
将各成分加入蒸馅水中,揽混均匀，静置约10 mi,加热煮沸至完全溶解，调至pH7.2土0.1.高压灭菌121℃，15min。
四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液
A.2.1基础液
牛肉旁
氯化钠
碳酸钙
蒸馏水
1 000.0 ml.
除炭酸钙外，将各成分加人蒸馏水中,搅混勾，静置约10 min,灿热煮沸至完全溶解，再加人碳酸钙，调至pH7.010.1.高压灭121℃，20minA.2.2硫代硫酸钠溶液
蔬代蔬钠(含5个结晶水)
蒸馏水
高压灭菌12iC,20 iminl。
A.2.3碘溶液
碘化钾
蒸馏水
灿至 100. 0 mL
加至100.0 m
将化钾充分溶解于少量的蒸馅水中.再人礁片，振擦玻瓶垒碘片全部熔解为止，然后加蒸馏水至规定的总量,贮存于棕色瓶内，塞紧瓶盖备用。A.2.40.5%煌绿水溶液
蒸馏水
溶解后，存放暗处，不少于1d,使其白然灭菌。A.2.5牛胆盐溶液
牛朋盐
蒸馏水
100. 0 n.
加热煮沸至完全溶解，高压灭菌121℃，20 i。8
A.2.6制备
基础液
硫代硫酸钠溶液
碘溶液
煌绿水溶液
牛胆盐溶液
GB/T 4789.4--2008
临用前按上列序，以光菌操作依欲加人基础中，每加人一种成分，均应摇勾后再加入与一种成分：
A.3亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液
A.3.1成分
蛋白陈
磷酸氢二钠（含12个结品水）
亚硒酸氨钠
L-胱氨酸
蒸馏水
A,3.2制备
1 000.0 mL
除亚硒酸氛钠和 L-胱氨酸外，将各成分lil人蒸馏水巾,搅混均匀，置药10min,加热煮沸 5 min至完企溶解，冷至55以下，以无菌操作加入亚箍酸氢钠和 1g/l l-胱氮酸溶液i0 mL（称取0. 1多 1-胱氢,加 1 mol/L 氧化钠溶液 15 加L,使溶解，再加无菌蒸馏水至 100 mL即成：如为 DL胱氨酸，用量应加倍），谣.调至pH7.0士0.1.A.4亚硫酸铋(BS)琼脂
A.4.1成分
蛋白陈
牛肉膏
葡萄糖
硫酸亚铁
磷酸氢二钠
柠檬酸铋铵
业硫酸钠
蒸馏水
A.4.2制备
0. 025 或 5. 0 g/L水溶液 5. 0 mL2.0g
1 000. 0 mL
将前三种成分加入300mL蒸馏水（制作基础液），硫酸亚铁和磷酸氢二钠分别川人20mL和30rmL蒸馏水中,柠酸铋铵和亚蔬酸钠分别加人另一20 mL 和30 mL蒸馏水中,琼胎加人500 ml蒸馅水中。然后分别搅拌均勾,静置约30 min,加热煮沸至完全溶解，冷至80C左右时,先将硫酸亚铁和磷酸氢一混，衡人基础液，混勺。将柠檬酸铋铵和亚硫酸钠混句，倒人基础液中，再混勾。调至PpIHI7.5十0.1,随即倾人琼脂液中，混合均勾.冷牟50℃～55℃，加入煌绿溶液，充分混匀后立即倾注平血,每血约20 ml。
注：本培养基不带要高玉灭茎，在制备过程中不宜过分加热,邀免降低其选择性,贮于室温暗处，超过小h会降低其选摔性，本培养基宜于为关制备，第二使用。
GB/T 4789.4—2008
HE(Heklwcn Enteric)琼脂
A.5.1成分
牛肉膏
水杨素
燕馏水
0.4%溴香草酚蓝溶液
Anulrade指示剂
A.5.2制备
18.0 g~20. c g
1 000, 0 mlL
20. 0 ml.
20.0 tnl.
将前面·七种皮分溶解于400mL蒸馏水内作为基础液;将兼脂加人于600tnL蒸馏水内，加热溶解。加入中液和乙波于基础液内，调至PH7.5+0.1。再加人指示剂，并与琼脂液合并，待冷至50℃55℃衡注乎血。
注：①本培养基不需要高压灭踏，在制备对过程不过分加热，谢避免降低其选择性：②巾液的配制：
毓代砾酸钠
柠橡酸铁镂
蒸馏水
B乙被的配制：
去氧卵酸钠
蒸馏水
@Andrade指示剂：
酸性复幻
1 m1ol/1,氧氢化溶液
蒸鹤水
100.0 ml.
100.0 ml.
将复红溶解于蒸馏水中，入氢氧化钠溶液。数小时后如复红褪色不全，再加氢氧化钠溶液1 mI.-~2 mI.c
水糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂
A.6.1成分
L-赖氨酸
去氧胆酸钠
柠檬酸铁铵
硫代硫酸钠
氯化钠
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