【国家标准(GB)】 食品卫生微生物学检验 副溶血性弧菌检验

HCS 07. 100.30
化北和家标准
GB/T 4789.72008
代 GB/T 4789,7---2003
食品卫生微生物学检验
副溶血性弧菌检验
Micrnhiniogical examinatinn pf foca hygieme-Examimatior pf Vibrio prahaemolyticus2008-05-16发布
致码防
中华人民共和国卫生部
中国国家标化管理委员会
2008-11-01实施
TE/T4789.7—2008
水标准修改采用了美圈食品药品管理局（FDA)《细菌半分析于瓜\第\章：窄乱弧荫、刷落血性弧菊创伤菌和其他菌(BacreriologicalAnlyticalMnunl.Chapter：VitrincholeritV.parahaemeIyiirus.V. tuinifirus aad other vibriu spp. .本标准与FDA方法相比主要区别妇下：将样品制备时取样量50 g(mL)修收为2 g(mL);将增菌时间16h~181修改为811185;增斯科马嘉孤菌选择性平板：
-—增如全白动组菌少化鉴定仪VITEK；沉原表中增加了新的五清型。
木标准代荐G3/4/89.72003≤食品卫生微牛物学检验副落血性弧葡检验》。本标准自实施之H起，GB/T4789.72003同时废止。本核准寸GB/14789.7-2903相比主要变化如将选择性增菌液山氛化钠结品紫增菌波改为3%氯化钠性白陈水；将选择性分离培养基由氯化钠熊糖琼猜和嗜盐菌选择性琼脂改为硫代硫骏盐-柠檬酸盐肌盐熊糖坏脂和玛嘉弧菌显色培养基：一增加API20E诊新试剂条及全点动细生化整定仪VITEK：潜加血清学分型
将动物试验改为神奈川试验
增加最可能数检素表
本你雅的录A、陆氯B对规茄非附录，本标准自中伴人民共和国卫生部器出并与可。本标雅负劳起草单位：中国焱病预防控制中心营养与食品安全所，本标准参血过草单位：福处省疾病资防控制中心、渐省疾病预防控制中心，中回检验检疫科学研究院、北京市疾病预防控制中心，本标淮主要起草人：刘秀梅、陈地、马孚飞、程苏云、陈意长、陈倩。水标雅所代替标推的所次版本发和情况为：- GH4789.7 1981.GB/T 4789.71994,GB/T 4789.7 20031范圈
食品卫生微生物学检验
副溶血性弧菌检验
本标准规定了食品中副济血性弧菌（Virinaraicemetyiicus)的检验方法，C/F 4789.7--2008
本标准适用于水产品皮食物中幸样品中烈溶而性弧菌的检验，其他食品可参照使用。2设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外.其佣设备和友料如下，2.1证温培养箱:36℃±1'℃。
2.2冰箱：2℃~5℃
2.3沟质器或无菌乳，
2.4大平：感景0.18：
无管:18 X180 :,1 mx10 nm.
2.6无菌吸管:1 nL(具0.01 ml. 刻度),10 mL(H0.1 ml.刻度)战微量移液器及吸头2.7无菊锥形瓶::00 ml.,250 ml.2.8
无菊培养而：直径soInml.
2.9全白动微生物鉴定系统(VIEK）。2.:0
蘭于术剪、镊子。
3培养基和试剂
3.13%氯化锅碱性蛋陈水（APW)见第A.1章3.2硫代硫酸盐柠橡酸盐正盘-蔗糖(TCBS)琼脂：见第A,2章。3.33%氛化恢蛋白豚大豆（-SA)琼指：见第A.3章。3.43%氛化钠三糖铁(TSI)脂：见第A.4章3.5嗜盐的试验培养基：见第A.5章，3. 63%氮化钠比露醇试验培养基:见第 A.6 章。3.73%案化钠赖氮酸脱羧酶试验培养基：见第A.7章。3.83%氯化钠MRV培养基:见第 A.8章，3. 9 我素既血凉脂:见第 A. 章,氧化酶试剂:见第A.10 章。
苹兰氏染位液：见第A,11，
ONPG 试剂:见第A,12章，
Vges-Proskater(V-P)试剂:见第 A..3 章科玛嘉(CHIROMagr)强显色培养基”，3.14
API20F生化鉴定试剂盒成VITEKVTC生化鉴定卡！，由法医生初梅里埃公可是供的产品的窄品名．给出这一信忘是为了方便本标准的佳用者，并不表示对该产品的从可。如果其等效严另具有相同的效是，则可使,这些等效的产品同法国科妈嘉公词摄法的产品的商品名，给出这信息是为了方使不标的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产显只有相同的效果，则使川这些等效的产品。1
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A检验程序
副溶血性孤菌检验挥序见图1..
祥品25（mL)+225mL3兆氮化钠碱非蛋白陈水3%紫化钠性笃白陈水3管×3个合适的释降度如架迹行足性您测不确逃行此步操36±1，818h
硫代硫酸战一好檬酸培一县培一解瑞脂或释鹭露菌显色落葬型划线公感36+1r, 18h24h
最可疑菌
玲，革兰民
花蘭糖铁凉脂，學
生化试验
中密化整城
结聚按告
副溶血解瓣菌检验程序
5操作步骤
5.1样品制备
爱琼暗
5.1.1冷冻样品应在45℃以下不超过15或在25采超过1%不解冻，若不能及时检验，应效下15℃左右保存：非冷炼而易离样品应尽可能及时检验，公翁及时恰验，应吧~5汇冰箱保存,在24 h内检验
5，.？负类和头足类动物取表间组筑肠或鳃，贝类敢全部内容物，包括贝肉和你液：甲光类整个动物，或者或物的中心部分，包措历和，如为带壳贝奖或而壳类，则应先在白夹水中蔬制外壳并用手表面水分，然后以无蘭操作打牙外壳接上述要求敢相应部分。5.1.3以无菊梁作攻检样25g(mL），加人3氯化钠碱性蛋白豚水225mL：用旋转万片式均质器以8ocr/min均震1ni或拍t均质器拍正2ii制条戒二：10的均每稀释液，无均质器.则将样品放人无菌乳钵中磨碎.然后放在50℃mL的火菌容器内，加225ml.35氟化钠碱性白陈水,并充分振荡。
5.2增菌
5.2.1 定性检测
将上述1:10释液36℃1℃培养&h~18 h.2
5.2. 2定量检测
G3/4789.7—2008
5.2.？.1用灭菌吸管吸取 1==2稀释液1 ml.注入含有 9 ml3%氯化销碱性货白陈水的试管内:振擦试管视勾，制备1：100的稀释波5.2.2.2另取1ml.火商吸管，夜上条操作依次制备10倍逆增稀释液每递增稀释：·饮，换用一支L灭菌吸。
5.2.2.3根据对检样污染情况的估升，选搭一个连续的适官稀释度，年个薪释度接种三支含有9ml，3%氛化钠性蛋白监水的试管，每管接种1。置℃土1恒湿箱内，培养8~18h5.3分离
5.3.1在所有最示竺长的试管战增菌液中用接和环沾圾一环.于1拐-板或科玛嘉弧菌显色培养基平板上划线分离，支试管划线-缺平板，于36℃±:1℃帝养18 h~24h5.3.2典型的副溶而性弧菌在TCBS 上呈圆形、半透明、表而光滑的绿色崩落,而接种环轻触，有奖似口香糖的质感，肖2II~-3 mm。从培养箱瑕山TCBS平板后,应尽快不趋过：)挑瑕蒲落或标记要最的菊落。典型的谢血性胍莉而察玛嘉弧菌显色培养辈上旱剑形、明、表面北滑的粉紧负萄落，直径2~3mt
5.4纯培养
挑取三个或以,上可凝菌游,划线 3氯化钠蛋乌陈大5琼脂平板,36'C一1'C培养18h24 h。5.5初步鉴定
5.5.1氧化酶试验：挑选纯培养的单个菌落进行氧化酶试验溶血作弧的为氧化酶阳性。5.5.2涂片能检：将可疑敲游涂片，进行革兰氏染色,镜检观察形态。避溶血性蛳菌为革兰氏荫性.品精状、弧状、卵圆状等彩态，光录拖，有鞭毛，5.5.3挑纯养的单个可商落，转种3/氛化钢=黏钱源脂时井款莉底层，36℃=.1境养24观察结果，配溶恤性弧菌在3%氧化钩三糖铁能中的友应为底层变或不变熊，无气范，斜而额色不变红色加深，数汀
5.5.4磨盐性试验：挑坂纯培养的单个可疑落,分别接种于不同氯化钠浓度的胰陈水,3G一1增养24h：观察液体混浊请况：副溶止性弧能在无氯化钠和10头氯化钠的陈水中不车长或微竭兰长，在7鼠化钠的胰陈水中牛长吐碰。5.6确定鉴定
5.6.1生化减验取纯培养物分别接种含8头氯化的甘露萨、赖氢暖、MR-VP培养.3E'C+1培养24l-48h届观察结果，隔夜降养物行0NPG试验。5.6.2AP120:化鉴延战剂盒或VTTEK：刮取3%氯化钠胰蛋滕人豆琼脂平板上的单个菌落，用生理盐水制备成浊度适当的细脸悬浮液，使,刀API20E4化鉴定试剂盒或VITEK鉴定，5.7报告
当检出的可疑菌落生化性状符合表1要求时，报代25g(ml)样品中检出剖溶血性弧菊。如果进行定检测，根据证实为刷溶血性孤菌闭性的战管管数，查最可能数(MPV)恰表，报告每克（点升)副辫血性弧菌的MPN佰，副溶而性弧菌主要性状与其仙孤茵的鉴别见表2。表1副溶血性弧菌的生化性状
说验领
苹兰医染色镜检
缅化游
明性，光芽孢
G/T4789.72008
试验项目
葡菊糖
什鶴醇
分解荀萄销产气
碳化氧
预英敏脱接饰
丝：「附作;一阴性。
到落生菌
V. gharahaemoiyti
创術设商
V.tuinifieus
海药颈菌
V.alginotgzicus
V.chaiene
激态弧菌
河弧茵
Vfiurnalss
弗氏要菌
V. furmssii
V.metschniaaui.
军到斯卵南
注：nd友示未试验示可变。
血清学分型(可选择)
表（续）
菌的鉴型
嗜盐性试验
氯化钠含量/%
6.1制备;接种两管 3%氯化钠淡蛋陈人豆琼胎试管斜面,36℃-.℃培养1S h~-21 h。用含 3为氯化钠的兴溶波汁洗3火氯化钠胰蛋白陈人豆琼脂斜面培养物，获得浓厚的菌悬液6.？K抗原的鉴定：取管上述制务如的菊志液，管先用多价K抗加清退行检测，出现疑集反瓜时中G3/3 4789.7—2003
单个的抗血谱洗行检测。用笔在张坡片「划出适当数量的间和一个对照闻隔。在封个隔内各滴加·漓菌悬液，并加一滴柑当的K血清。在对照问隔内加一滴3%氟化钻落液。轻微倾斜玻片，各成分相混合，再前后倾动坡片1min。阳性凝集反成应可以立即观察到。6. 3门抗原的鉴是:将另外一管的案悬液转移到离心管内,121院灭菊 1 h灭菌后4 00 r/m:离心15 m,存去上层液体,沉淀用生理盐水洗三次;每次 4 C03 1/min 离心 15 min,最后一次离心后留少许层液笨，将细胞聚弹起制成菊悬液，用蜡笔将破片说分成朽等的问椭。在衔个尚隔内加人滴菌悬液,将○群亢清分别北一滴剑间内,最后一个间隔加一滴生理盐水作为白凝对照。轻微倾斜片，使冬成分相混合，再前后侦动波片：in影雄凝巢疫麻以立即观察到，如果未见到与（）群血清的凝集反应，将菌悬液121再次高压h后·章新检测。如果仍科为阴性.则培猴物的抗原未知。根表3技告而清学分型结聚
副溶血性弧菌的抗察
神奈川试验
穿2719.34,4
160.61-68
$t,56.57,$8,50.2,73
967,68,73
神奈川试验是在我妻还综瞻上测试是否存作特定溶血素：换素川试紧阳性结果与剑溶血证孤菊分竭株的致病性显著相差。
用接种环将战菌株的3不化钠胰能自炭关登琼脂18h境养物点种衣面「爆的我要氏血惊脂平板。得人平板上可以环状点种几个菌1℃童养不翅过2 h,并立即观察。阳性结果为菌将月调平透即环的3溶血，
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A.13%氯化钠碱性蛋白胺水(APW)A.1,1成分
蛋白陈
氨化镇
蒸馏水
pH 8.5±c.2
A.1.2制法
附录A
（规范性附录）
培养基和试剂
1 090.0 m1
落上述成分混合，121℃高压灭荫10minA.2硫代硫酸盐-柠檬酸盐~胆盐-蔗糖(TCS)琼脂A.2.1成分
多价蛋白陈
醇母波
柠体酸钠(CH,O,Na-2H,0)
硫代硫酸钠(N,0，H,0)
氮化钠
牛胆汁梭
柠檬陵铁
胆酸钠
香草酵
潮荷草酚垫
蒸馏水
A, 2.2制法
1 00c.0rnL
加热煮沸至完个溶解，最终的pH应为8.6主C,2。冷至5CC倾注平板备用。度.33%氢化钠胰蛋白陈大豆（A)琼脂A.3.1成分
陕签门膝
大豆蛋白陈
氯化钠
蒸馏水
A.3.2制法
- 0cO. 0 mL
将上述或分混个,加热并整轻揽拌至溶解，21℃高压灭菌15 mjn,调节 pH至7.3士0.2，6
4.43%氯化钠三糖锻（)琼脂
4.4.1感分
蛋白藤
川示蛋白胺
小肉膏
学母浸奇
氯化钠
葡萄糖
硫龄亚铁(上esO,）
苯酚红
硫代硫酸钠（N总容
A,4.2制法
说节p1,使为7.4
面长4 cm-~5c深度火2
A.5嗜盐性验培辨基
腹蛋当陈
氯化钠
蒸解水
pH 7. 2-0. 2
A,5.2制法
装到选容的品
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凝2]℃高压蒲「in，制成斜面，斜nm
配蛋白豚水，共配制叫瓶，每瓶100m。分别人不扇量的策化：1）不；（2）3g；（3）6g：（4）1高压灭菌15miz，在无菌条件下分菱试管A.63%氯化钠甘露醇试验养基
A.6.1或分
小肉膏
氯化钠
磷酸氢—钠(Na:HPO:2H,O)
0.2%溴扇香草酚蓝液
蒸馏水
A,6.2制法
1C00.0 mL
将上选成分配好层，分装每瓶：00mL，121C高压火案15min，另配10%甘露脖溶液，同时高正灭菌。将5糖落液加人于10℃n培养基内，以无菌操作分装小试臂。G8/TF 4789.7—2008
A.6.3试验方法
从琼脂斜面上挑坂培养物萎，于36℃十1℃培养不少于21 h,观察结果。[露隙阳性者培养物呈黄色，阴性为紫色。
A.73%氯化钠赖氨酸脱羧酶试验培养基A.7.1成分
蛋白陈
母浸膏
蒸銘水
1.6%漠甲酚紫7.醇溶液
L-颗氨酸
氯化钠
A.7.2、制法
1 0c0.0 ml
1.: g/1or mt.或 1. 3 g/10 mI.39.0g
综赖氮酸以外的成分血热游解后,分装每瓶100mL,校止pH爷6.8，再按9.5%的比例人赖氮酸，对照培养基小加氮酸：分装灭菌的小造管内，每心.5m1「归滴加一层液怀石塘，115C高灭菌1cmin
A.7.3试验方法
从琬脂祭而［排取培养物接种、于36℃土1℃培养不少于24h,观察结架、赖氨酸说羧酶阳性冶于产碱叶和萄糖产酸·故培基仍应呈紫色，阴性各无碱性产物怎因葡萄糖产酸而使培养变为黄色，对照管应为黄色。
A.83%氨化钠M及-F培养基
A.8.1成分
葡萄糖
磷酸氢钾(K,HPO)）
氢化钠
蒸馏水
PH 6. 5±0, 2
2.8.2制法
1 900. 0 mL
将各成分溶子蒸馏水,分裂试管：121C高压灭菌15 min。A,9我麦无血琼脂
A.9.1成分
醉哥没音
强白陈
磷峻氢二钾（KHPO）
结品紫
蒸馏水
pll 8,0+o.2
4.9.2制法
1 009.0 ml
C/l 4789.7—2008
将上述成分混合,如热至100℃,保持30 min,冷至6℃~～50℃、与50 预先洗涤的新鲜人或象红纸抱（金抗凝血剂)混合，倾注平板，彻底干燥平效.尽快使用：A.10氧化酶试剂
A, 10.1 试剂
A.10.1.11%盐腰一中基对萃-按溶液：少量新鲜配制，丁冰箱内避光保存。A. 10. 1.21% α萘酚 7.醇济羧A.10.2试验方法
4，10.2.1政向急洁净滤纸沾取菌落,加盐酸.中基对苯二胺溶液-滴性者呈现粉红色，并逐渐相深;再lα-紫酚-乙醇溶液---滴，珀性者于0.5 min内呈现藓蓝色。阴性下2 n内不变色,，A，10.2.2以毛纠效管吸取试剂，占接滴加三菌落上，其显色反成与以上相同，A4.11革兰氏染色液
A.11.1结晶紫染色液
A,11.1.1成分
结品紫
9兴乙醇
二兴草峻铵水泌
A. 11. 1. 7制法
8o.G nil.
将结品紫完企解于乙醇巾，然后与草酸铵溶滚混台。A.11.2革兰氏碘液
A.1:.2.1成分
碘化饼
蒸馏水
A. 11. 2. 2 制法
冷碘与碘化钾先逛行渠合，加人蒸箱水少许充分振密，得完全溶解后再加蒸馏水至3Cml.A、11.3沙黄复染液
A、11.3.1成分
55%醇
蒸馏水
A.11.3.2制法
将沙黄溶解于乙巾.然后用蒸馏水稀释，A.11.4染色法
三）将涂片在洒精汀火焰！固窕，滴加结品紫染色液，染1Imi,水洗滴加革兰氏碘液，作「nir·水涉，b)
滴加95杀乙摩脱色，药1！～30S，直至梁色液被洗掉，不要过分脱色，水选滴加复染竣，复梁1min，水洗、待「镜捡，9
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A. 12UNPG 试剂
A.17.1线冲液此内容来自标准下载网
A.12.1.1成分
磷酸一氢钠(NaFl,PO,II)
蒸水室
A. 17. 1. 2制法
将梭一氛钠溶于蒸水中.调市EH俏至7.C：缓冲液胃冰箱保存。A. 12.2 ONPG 溶液
A.12.2.1成分
邻醋其酚-3-D-半乳糖((UNPG)
蒸馏水
缓冲液
A.12.2.2制法
15, 0 ml
将（NPG在37℃的蒸馏水中溶解，证人缓冲液。OVPG落液置冰箱保存，试验前,将所需而最的ONFG溶液加热37C
A.12.33%氯化钠溶液
A.12.3.1成分
氨化钠
蒸馏水
A,12.3.2制备
1 Goc.o tmL
将氯化钠溶丁蒸馏水中，121℃高压火菊20min.12. 4试验方法
将待检培养物接视3%氯化钠三糖铁惊脂；36℃--1培养18h.挑取1满环新鲜培养物接种于0.25 mI.3%氯化钠溶液，在通风谢中.滴加1滴[苯,匀后罩 37℃水裕5 min，加 0.25 mL 0VIC辫液,36℃二1℃培养观察24 h，阳结果是黄色：阴性结果则21h不变色A. 13Voges-Proskauer(V-P)试剂A.13.1成分
FH液：
-茶纷
无水乙醇
乙液：
氢氧化钾
用蒸翻水加金
表.13.2试验方法
100. 0 mI.
将 3%氯化钠胰蛋白陈大豆琼脂生长物接种3死氯化钠MR-VP培养苯,36℃11r培养 48h取1 mL培养物,转放到-个-试臂内,加 C. 6 mL 用液,摇动。加 0. 2 tmL 乙液,摇动。随意加一点肌酸结鼠1后察结果。阳性结果显现供红的粉红色，10
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