【国家标准(GB)】 动物源性食品中β-受体激动剂残留检测方法 液相色谱-质谱/质谱法

ICS67.120
中华人民共和国国家标准
GB/T21313--2007
动物源性食品中-受体激动剂残留检测方法液相色谱-质谱/质谱法Analysis of β-agonists in foods of animal origin by high performanceliquid chromatographytandemmassspectrometry声明：本资料仅供学习和交流，严禁用于商业用途！目录下载：http：//biaozhun.ys168.com2007-10-29发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2008-04-01实施
1范围
动物源性食品中β-受体激动剂残留检测方法液相色谱~质谱/质谱法GB/T21313—2007
本标准规定了β-受体激动剂类兽药残留检测的制样力法和液相色谱-质谱/质谱确证方法。本标准适用于猪肉、猪肝、猪肾等动物源性食品以及猪尿中克伦特罗、沙丁胺醇、安布特罗、特布它林，非诺特罗、摄莫特罗、莱克多巴胺、异芮喘宁等8种9-受体激动剂类残留量的高效液相色谱-质谱/质谱测定。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注月期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括助误的内容）或修订版均不适手本标准，然而，鼓励根据本标准送成协议的备方研死是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验案用水规格和试验方法（GB/T6682—1992，neqSO3696：1987）3方法提要
试样中3-受体激动剂残留经酶解后，再用商氯酸溶液提取，经过滤和离心后，上清液用HLB和MCX固相卒取柱净化，液相色谱/串联质谱仪测定，外标峰面积法定盘。4制样方法
制样操作过程中应防正样品污染或残留物发生变化。4.1动物肌肉、肝脏,肾脏
声明从奔颜塑部样中最出奢液装谨品纤离光擦舫膜痛殖揭辞机究分鸭舒玛！囊头解器中，密封，并标明标记，于一18C以下冷冻存放。4.2猪尿
从所取全部样品中取出有代表性样品约500g，充分混匀，装人洁净容器中，密封、并标明标记，于一18以下冷冻存放。
5试剂和材料
除特殊注明外，本法所用试剂均为色谱纯，水为CB/T6682规定的一级水。5.1甲醇。
5.2高氯酸：分析纯。
5.3氮水：分析纯（浓度25%~28%）。5.4甲酸(99%，ameiscnsaeure)。5.5氢氧化钠：分析纯。
5.6乙酸：分析纯。
5.7乙酸钠(NaAc·4H,O).分析纯5.8乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH5.2)：称取43.0gNaAc·4H.O利25.2g乙酸，加水溶解并定容到100tmb
GB/T21313—2007
5.90.1%甲酸水溶液。
5.105%甲醇氨溶液：量取5ml.氨水<5.3），用甲醇定容至100mL。5.1120%甲醇水溶液。
5.120.1mol/L商氯酸。
5.130.1mmo1/1高氧酸。
5.14β-葡糖醛酸苷肽酶/芳游磺敢酯酶溶液（βglucuronidasc/arylsulfatasc）（30U/mL）5.15标准物质：安布特罗（tulobutcrol,CAS：41570-61-0），特布它林（terbutaline，CAS：23031-25-6）、沙丁胺醇（salbutamol,CAS：51022-70-9）.非诺特罗（fenaterol,CAS：1944-12-3），福莫特罗（formoterol，CAS：73573-87-2）、克伦特罗（clenbutcrol,CAS：37148-27-9）、菜克多巴胺（ractoparminc，CAS：97825-25-7）异丙喘宁（mctaproterenol,CAS586-06-1）。纯度均大于等干99%。5.16标准溶液
5.16.1标准储备溶液：准确称取克伦特罗、沙丁胺醇、妥布特罗、特布它林、非诺特罗、福莫特罗、莱克多巴胺、异丙喘宁各00100g，分别用甲醇溶解并定容至10ml.,浓度为1000mg/L一18C冰箱中保存，有效期12个月。
5.16.2标推工作液：根据诺要，用甲醇将标准储备溶液（5.16.1配制为适当浓度的标准工作液。标准工作液应恢用前配制。
5.17HLB固相萃取柱(500mg，6mL)或其他等效柱。5.18MCX固相萃取柱(60mg，3mL)或其他等效柱。6仪器
6.1高效液相色谱串联质谱仪。
6.2电子天平：感基0.0001g。
6.3电子天平，感适0.01g。
6.4组织匀浆机。
6.5旋涡混合器。
6.6冷冻离心机（最大转速高于10000r/min）惠明：聚肉烯鹤悠誉学和交流，严禁用于商业用途！目录下载：http://biaozhun.ys168.com6.8酸度计0,01)。
6.9氮吹仪，
6.10固相萃取仪。
6.11超声清洗仪（功率5W)。
7提取及净化
7.1提取
准确称取10.0g样品，加入15mLpH5.2的乙酸-乙酸钠缓冲溶液（5.8），10001/min勾浆1min，再加入β-葡糖醛酸升肽麻/芳基磺酸酯溶液100L，于37C士1C檬酶解过夜。取出冷却后，用商氯酸调pH值至1.0，超声振荡20min，取出置于80C水浴中加热30min：放人冷冻离心机中，10℃10000r/min离心10min。倾出上清液，残流再用10mL0.1mol/L商氛酸游液提取一次，10000z/min离心。合并上消液。用1mol/L氢氧化钠溶液调pH值至4.0，此溶液待过HLB固相蒂取柱。7.2净化
7.2.1HLB柱净化
HLB相萃取柱（5.17）使用前用6mL甲醇，6mL水活化，将7.1提取的溶液以2mL/min~3mL/min的速度过柱，弃去滤液，用2mL5%甲醇淋洗，小柱抽干，再用6mL甲醇洗脱。洗脱液用氮2
气吹至近干。用3mL0.1mmol/L高氯酸溶液溶解残渣，供MCX柱净化用。7.2.2MCX柱净化
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MCX柱杜（5.18）.使用前用3mL5%甲醇氮，3mL醇.3mL水.3mL0.1mmol/L高氧酸（pH4.0）谛液活化。将7.2.1制得的溶液过柱，弃去滤液，依次用1mL印醇、1mL2%甲醇水溶液淋洗，最后用7ml.5%印醇氨洗脱，洗脱液用氮气吹近干后，用甲醇-0.1%巾酸水（10+90）定容至1.0tmL，旋涡混合1min，用手HPLCMS/MS测定。
7.3基质加标标准工作曲线的制备将混合标准工作液<5.16.2)用初始流动相逐级稀释成0.5够/L～50.0μg/L的标准系列溶液。称取与试样基质相应的阴性样品10.0g，加人标准系列落液1.0mL，按照7.1、7.2与试样同时进行提取和净化。
8液相色谱-质谱/质谱测定
8.1液相色谱条件
8.1.1色谱柱：ACQUITYUPLCTMBEHC柱（100mm×2,1mm，1.7μm）或其他等效柱，8.1.2流动相：甲醇-0.1%甲酸水梯度淋洗，参考梯度条件见表B.1。8.1.3流速：300xL/min.
8.1.4柱湿：40℃。
8.1.5进样证：10μL。
8.2质谱参考条件
离了化模式：电喷券电离正离子模式（ESI+）：质谐扫描方式：多反应离子监测（MRM）：其他参考质谱条件见附录A。
9定性
9.1保留时间
试样中寻标化合物色诺峰的保留时间与相应标准色谱峰的保留时间一致，变化范围应在士2.5%之声：各花瓷料解参保舒免装管梦角手简亚用途！自录下载：http://biaozhun.ys168.com9.2信噪比
待测化合物的定性离子的重构离了色谱峰的信噪比应大于等于3（S/N≥3），定离了的重构离了色谱峰的信噪比应大于等于10(S/N≥10)。9.3定靠离子、定性离子及子离子丰度比每种化合物的质谱定性子必须出现，至少应包括一个母离子和两个子离子，而且同一检测批次，对同一化合物，样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度比与浓度框当的标准溶落相比，其充许偏差不超过表1规定的范围。各化合物的参考质谱图和标准溶液色谱图见附录C、附录D。表1定性时相对离子率度的最大允许偏差相对商子度
允许相对偏差
10定量
按式(1)计算残留量：
>20%~50%
土25%
eVX1000
mx1000
>10%~20%
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戏中：
x——样品中待测组分的含基，单位为微克每于克（ug/kg)；c——测定液中待测红分的涨度，单位为纳克每旁升(ng/mL)；V定容体积，单位为旁升（mL)：m一-样品称样量，单位为克(g)。注：计算结带扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表丧示，保留两位有效数子。11方法的检出限和回收率
11.1检出限
按能够准确确认的月标化合物浓度来估计各月标化合物在不同样品基质的检出限，样品基质、样量、进样量、色谱分离状况、电噪声水乎以及仪器灵敏度均可能对样品检出限造成影响，因此噪声水平应从实际样品谱图中获取。当某标化合物的结果报告末检出时应网时报告样品检出限。克伦待罗、沙丁胺醇、要布特罗、待布它林、非诺特罗、福莫特罗、莱克多巴胺、异芮喘宁在动物组织和猪尿中的检出限为0.10g/kg，定量限为0.30μg/kg。11.2回收率
回收率试验采用三个添加浓度（0.1pg/kg.0.5μg/kg、2.0μg/kg）计算方法的加标国收率。猪肉中8种受体激动剂的加标回收率在86.3%～118.2%之间，相对标准偏差（RSD)在4.6%～18.4%之间；猪听中8种+受体激动剂的加标回收率在85.3%~119.7%之间，RSD在2.9%~14.7%之间：猪肾中8种β受体激动剂的加标回收率在77.5%～116.8%之间，RSD在3.0%～15.5%之间：猪尿中8种β受体激动剂的加标回收率在78,5%~113.5%之间，RSD在32.2%~16.9%之间。具体见附录E。12质量控制和质益保证
12.1精密度和准确度试验
在分析实际试样前，实验室应达到可接受的销密度和准确度水平。通过对加标试样的分析，验证分析方法的可靠性。免费标准bzxz.net
声明取本资料份基质与契家流样相的座百样用制咖风标准藏液h物制备好的加标试样摄生述m方法进行分析，各日标化合物的同收率应在75%~125%范囤内，RSD小于20%。在进行实际试样分析之前，应达到上述标准。当试样的提取、净化方祛进行了修改以及更换分析操作人员后，应重复上述试验并直至达到上述标准谁。实验空每6个月应进行上述试验，并至达到上述标准。
如果可以获得与试样具有相似基质的标准参考物，则可以用标准参考物代替加标试样进行精密度谁确度试验。
12.2方法空白
每个批次最多15个样品，需做一次方法垒白试验，12.3质控样品
每个批次最多15个样品，需带一个质控样品。质控样品可以是标推参考物，也可以是已知浓皮的加标样品。根据加标浓度，目标化合物的测定值应在标准值的75%~125%范围之内。12.4保留时间窗口
每100次进行窗口确定标准溶液的分析，确定保留时间窗口的正确。当更换色谱柱或改交变色谱参数后均应使用窗口确定标准溶液对保留时间窗口进行校准。12.5质谱的质量数校正
每周用校正液进行一次质谱仪的质量校正，确保监测离子的质最数不发生改变。4
6玻璃仪器的准备
所有循重复使用的玻璃仪器应在使用后尽可能快地认真清洗，消洗过程如下：用该仪器接触过的最后一种溶剂冲洗；依次用己烷和丙酮冲洗；
用含碱性洗涤剂的热水清洗：
依次用热水和去离子水冲洗；
依次用丙酮、己烷和二氯甲烷冲洗GB/T21313—2007
使用加人含有碱性洗涤剂的热水的超声波清洗设备对清洗有很好的效果。如果使用刷子需特别注意不要划损玻璃仪器的表面。
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参考质谱条件：
毛细营电压：3.3kV
锥孔电压：60V：
射题透镜1电压：40V：
射频透镜2电压：0.5V：
源温度：100℃
脱落剂气温度：350C；
脱溶剂气流述：580L/h；
电子倍增电压：650V；
喷捷室压力：0.28Pa;
其他质谱参数见表A1。
附录A
（资料性附录）
参考质谱条件1）
表A.B种β-受体激动剂主要参考质谱参数化合物
异丙嘀宁
特布它林
沙丁胺醉
母离子
子肉子
碰撞能低/ev
严禁用于商业用途！且车载：http://biaozhu.vs168.cqm声明：本资料仅供学习和交流，非诺特罗
案克多巴胺
克伦待界
福莫待罗
妥布特罗
注：对不质谱仪器，仪器参数可能存在差异，测定前应将质谱参数优化到最佳，，定贷离子、
1）所列参考质诺条件是在Micromass\-QuattroUltimarMpr质谱仪上完成的，此处列出试验用仪器型号仅为提供参考，并不涉及商业目的，鼓励标准使用者尝试不同厂家或型号的仪器，6
时间/min
附录B
(资料性附录）
参考液相色谱条件
表B.1分离8种β-受体激动剂的参考梯度条件0.1%甲酸水/%
表B.28种β-受体激动剂的参考保留时间(RT)化合物
异内略宁
布它称
砂丁胺醇
非诺特罗
莱克多巴胺
克伦特双
极奠待罗
妥布特多
RT/min
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甲醇/%
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附录C
（资料性附泵）
8种β-受体激动剂的子离子扫描质谱图202.7
120140
2 266-2p/z
图C.1克伦特罗二级质谱图
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67.5ra.9.9.6
100120
275.af9o.g3
191.61211.9
300320340
260280
200220240
非诺特罗二级质谱图
0+.61.071.190.6
241.6262.9
220240
福莫特罗二级质谱图
GB/T21313—2007
287.2316.7334.9249.0
300320
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134.7148.7
101.8t.118.7l
211.8224.7
188,6195.1
5060708090100110120130140150160170180190200210220230240250异丙喘宁二级质谱图
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ofaz 0g
165易 207,52只22-25 6
22.1306.67336.9348.9
34.7148.9
20022024026026030200
120140160
莱克多巴胺二级质谱图
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59.870-874.0.85.890.6.13.7121.5135.020.7152.91-190.206.721.7226.9244.9
5060708190100110120130140150160170180190200210220230240250图C.6特布它林二级质谱图
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8-8550 841181
204.6213.9
5060708090100110120130140150160170189190200210220250240254图C7妥布特罗二级质谱图
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67.9..79.4
90.6.105.8
135.918.81568o
821.0225.7239.9239/
80.0193.4
5060708090100110120130140150160170180190200210220230240250图C.8
沙丁胺醇二级质谱图
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