【商检行业标准(SN)】 马流行性淋马管炎检疫方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1449—2004
马流行性淋巴管炎检疫方法
Quarantine method forepizootic lymphangitis2004-06-01发布
华人民共和国
国家质量监督梭验检接总局
2004-12-01实施
本标准的附录A和阿录B均为规范检时录，本标难由国家认证认可监督肾理委员会提山并与口。本标准总草单位：中毕人民共和国凹尔出人境检验检接局本标准尘要起草人，卢晓中，王作任、徐题。本标准系肯次发有的出人境检验扮疫行业标准。SN/T 1449—2004
1范画
马流行性淋巴管炎检疫方法
SN/T1449-2004
本标准规定了马筑行性淋巴管炎的病原分离鉴定，醇嵌免疫吸隔试验和皮内变态反应的检疫方法、本标准适用于进出境马行些淋巴普炎的检疫，2规范性引用立件
下列文件也的紊款过本标准的引用而成为本标准的款，风是注期的引用文性，其险后所有的修改单（不包括勘误的内容>改读订版均不运用于本标准：然而，效感报据本标陷送放协议的各方证究足否可使升这些文件的受新放本，凡尽不注日期的引用文件，共是新版术适开上产标准，GB/T1759.23食品工.生微生物学检验染包法、培养基利试剂G8/T能2分所实验建用水规格和试验方法3病原分高鉴定
3. 1器具
拧拭子、平血、外料剪、链子、恒温箱，商压灭菌器，销金耳、箔销灯、显热钝.起净工作台等、3.2培养基及试剂
3.2.1动物证器塔养基，制备方法见附录A3.2.2灭菌生理盐本，益兰无染版、动物肺半培养基、4必菌萄转肉汤、糖发酥普，明独，蛋白麻水.靛基质试剂、燕酸亚铁晾脂、缓冲商微婚蛋白冻水、生牛乳等，3.2.3实验用水死GB/T8。
3.3深择
必染被检负物软化的六破溃的皮肤节、化址或病变游巴站，消毒处理后无蒂操作采取脓汁示先菌空试变士菌平血内·要宜接尤菌采取病弯组织决于无图平血中。驱汁用灭齿生杀适当筛择后在为被检划料，于瘤的痴纳现适量的105%--30%多氧化钾（机载化钠液或生班盐水.传共充牙弃制示检变。
3.4操作方法
3.4.1至做镜检查下载标准就来标准下载网
3.4.1.无频压片标本镜检
3.4.1.1.1用铂排取处增过的痴料于活净的裁玻上，疆萄洁净的盖我3.4.1.1.2在弱为下，先以显微镜！430答～500沿）检盗，然后再用动镜检查，中的流行生述巴答谈马伪皮值组织服浆函量双层膜即圆形或烈可形，—燃或两端类锐，大（3～4m×2-3）菌体内为半液状并可可一季数个能活没运动的小颗粒，3.4，1.2染色标本检查
3.4.1.2.1开拷试于白接沾取被检动数化浓杜边或病变淋巴结、病变结节组织誉出液除排裁轰片3.4.1.2.2自然十燥后火熔定
3.4.1.2.3依照GB/T47路.28热定进行革兰氏菜色，3.4.1.2.4镜检办法同3.4.1.1.2。5N/T 1449—2004
标本背景炭紫色，白细胞内外可以请楚地有对洗行生巴管炎马伪皮殖组织咆浆当，呈淡灰色：菌休边焱呈紫色，小粒皇翻紫色剪黑色，3.4.2分离培部
3.4.2.1取制等好的动物脏器垢养基（见附录A)试管五支：无菌操作将采巢的品用接种情与取频互轻至以较人小的嵌液，或切取结节(游巴结殖织)内融小组识块，效置培幕基斜面下三分之一处。3.4.2.2将度种的试降胃28机满路养，培养起过10d向试内划灭菌兰到益水，加人量以不超过培养物为宜。
3.4.2.3经过1d~15d培养，在原接种部位上面出现乳白色季谈求色小菌落，之后苗落逐渐山现突起的皱招色泽也避渐变深，落皇按大的不整形被据，的皮症组组跑浆菌在培养基上呈以离丝为主的牛民发旁素来谈黄色或竭色，形成密起不整兆皱据菌落，初逐润后变干媒：3.4.3分商菌株监定
3.4.3.1显微镜检查：按典型或可显靶培养物存载装片上用生理盐水稀释加芷变片后进行显微境检查，子伪皮症组织胞浆菌显细不等，要分枝的酉丝体，有些菌丝木端形如炔瓶快胀大分，即分生泡于，有下盗可见到厚照范子及关带泡子：3.4.3.24%前出轴肉汤培养：接种典型成可疑培养物于45就制精肉询培养6d--13d.液体保持避明.做而生长呈英揭色多策谐拍范腹，培养时川教长，表而兰微粉详.液体深部有时至境高梁粒大毛期择发育：
3.4.3.3生化试验：取典型或可累纯培养物衣据表1进行生化试验、所有生化试验管均在28亡恒温培关箱培养10。
表1马伤皮值趋赖案菌生化特性试验名称
临基质及厉
3. 4. 4 结巢判定
查化尔试验明胶
六发降六发用
萨醇：孔然
【六收能不发降
不黑醛
权撕3.4.3.1.3..3.2和3.4.3.3的结果进行判定。合前逆伪皮值组织脂装需特征的判定为拍性.
上酶联免疫吸附试验
4.1材料
4.1. 1抗底、降标抗体、阳批血清.阻栏断流。4.1.2抗源包被液、对用淡、PFS洗涤液、整止液配制力法见附录卫，4.1.3即坏反应板,酶标仪,加弹器等，4.1.4被控血清，
4. 1. 5变览用水见GB/T2
4.2操作方法
4.2.1包被：轻抗原用护噪包被激（见附录第H.2帝）稀魅到工作浓底加人醛标内，起孔130nL，37℃作用1h后4℃球箱过夜，
4.2.2涨：弃去内液体，用PBS洗像被（附录第B.1章>一次，每次rei用吸水纸或毛巾拍下。
4.2.3封闭，孔如人封闭液（见附录第B.3章）1J)L,23记~25满转3min,按=.2.2步期洗涤、
SN/T 1449—2004
4.2.4加人待检血满和阴性，性血请对照：待控血消经5℃3心m:n灭活后，用PBS涤液做140倍稀释，按综号每孔加人IUW[L，同时，将稀释到工作浓度的防性血清对和阳煌血清对随加入对照孔，分别记为A1.A3,A3杆A4、A5,Ae孔，37它作币=h，豆4,2.2步强选嵌。4.2.5划人标扰体，孔均人100.上作浓性的酷标统体（）：800倍希料过氧化物酶标记的山羊抗T1gG)、于23--25它座荡奥音50min.重签4.2.2求选施，4.2.6加人底物：每加人100L料pH行捷股线冲胶配制的底物衰（附录第B.5章）、作用60 min。
4. 2.7、终止反应：每孔加人50&二终上液<见附效第B.1章)终北反应4.2.日测定OD恒：在醛联免疫检测仅上于405n波长处测定吸光度供(门）.4.3翁果判定
4.3.1算期性对照乎均直、阴它对照Q门平均值刚对照平均值(NC,>为A1A3利A3三个孔测定OL值平的值阳对点D平均值（PC.A+A和A6三个礼退定倪平均信.4.3.2莅抢样品的值为的联免疫检测仪测定的样品吸光遇间4.3.3按式(11计算S7P，并别定结果.SP首=(样品的OD 一N,:PC,一NC
S代表该接详品>值与NC的孝代示H熟半均值与阴对照D半均估的差，如5/F20.5.川州为抗依件，如S/120.5.则判为航休阴性。5皮内变放反应试验
5.1材粒
5.1.1试！：伪皮症组如跑浆菌紊或浓缩凸快皮症矩规泡跑浆菌素生理盐永，75%活精棉球放3.1新消尔灭哲球，
5.1.2、诉持：1ml延射盟、游标卡尺、剪毛剪等。5.2探作方法
5.2.1马伪皮值组织跑炭菌晕方法5.2.1.1用剪毛剪剪去被格马左他或在例颈部三分之一的中失部位的鼓毛·尽积约5t×5m，5.2.1.2先将剪飞位用手担起，再用渐标卡尺测最并记录皮肤皱的厚准：消再店克内老影马内皮植纠织胞浆菌衰U.2而L(出现指类大突起)5.2.1.3注射后34h,48b可725检声反应情况谢量升t录皮肤被整不度.5.2.2浓品马伤费痘组报胞浆菌表方法5.2.2.1开剪毛剪剪大被检马左见或侧频再一分之一的中火部位的放毛而板约3cm×cm5.2.2.2消币后支内正射浓结马快反症组纸脑条菌索0.2mL山现指尖大突起），5.2.2.3注射后21h,49k.部72检查反应情况，测量井记录支肽张而积。5.3结果判定
用马伪值组虾照浆离索试验时，制据皮头设染增率程度进行判定（见表2）。使用报组马学皮道组织脑装由表试验时，真技按肿服面积，即注射部位发生界限明显带哺性持续性弥强生的肿胀面积进行判定，判定标准见表2。
似反应的马·间一到在对致部再进行一次检测，两饮疑似者判是为阳性3
SN/T144—2004
标难判定
深程判定
表 2判定标准
表 3 载定标准
度快饮整增加厚度/mm
品0以下
3 1~-3, (
5,1以下
肿旺闻钥/eur
4.1--3. 0
3.1以上
附烫A
（规范性附录）
动物脏密培养基的制备
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取A,1、A2、A.3、A.4四神湿液各25mL，蛋立陈、水学蛋口、优菊树各1.0g家脂松1.5g-2.0x,用1 nn./T.氢划化销调pH为7.8，每支试营 5,0 mL分装,100℃派菌15Tin：室通冷凝后=亡保存备用。便用前将试管培养薪水咨游化，待温度障至4C℃～45七，每文试音加人0.5ml.无菌兰（或羊，免血消，室制成料面.
A：1脑组织没没：将牛（或弟，免)脑组烁款取50）%，加人U30mL费增水：4℃冷没34h，然后冠逆加温至10c℃15mir.-20mia后，用多层脱数市过滤，收集独减非加苯水至1000ml..1C0℃灭函15 min,4℃误存备用。
A2心识激，将（或单，免）心鼠统款取500g：入-330m水：4℃冷漫24h，然后迅速加温至1℃，15mir~201i-忘用多层脱脂梦布过满收英滤恢并加蒸简水至10Hml，1rC灭菌15min,4C存备用。
3开组识没滋将（或羊）你取500人0ml.水，60c℃高60并不断搅拌后，再将水湿开至110℃，经15rrim～20mli-1,月多送脱脂龄布过滤，收集液并加游增水至1oocmt130t灭菌15min，1t送径各月。A.4肿组织没滋，将牛（或羊，免）啤你取5908，加人1c2)ml蒸恼水，60℃7c加瓶60min非不断揽拌后，再水祖升至1℃，经15mim～20li:1月多层脱脂给布过滤.收操液并加蒸饱水至1ct.1t灭min备月，
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（规范性附景）
酶联免疫吸附试验溶液配制
B.PH8选染液含0.5ml./L吐·20,pH74的瞬度带爱凉液下列式别按次序加人1的体积的容器中，充分落解即成。氯化钢(NeC
潮化钾（Kcl)
酸二销(NmHPO,2H.O)
避钾(KE,FO,)）
n+m2C(Teen·20)
无离子蒸相水
H.2抗原包越糖).025mo/L.pH9.碳酸盐缓波酸N2O)
废酸金钠NaHC，
元离子蒸恼水
B.3封闭液
PB5洗涤液B,1>
生血清自蛋自
E.6终止液(2nnl/I.H,SO,
（H）
元与子族胆2
R5底物筛夜
100 aL
0. 2 m>) 球酸氢-销(Na,T[PO, *:2.O(:. R/T.)24. 7 mu. t mal/l. :3, 2 g::)
无出子蒸焰水
净照称4AB7S_22-消氢-双：3-2光理对-3-减酸门10%.潜折后暗好保.格用前加入39%x刘xH.i2.C5m!.r
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