【地方标准】 化妆品中维生素D2和维生素D3测定 高效液相色谱法

DB37/T3309—2018
化妆品中维生素D2和维生素D3测定高效液相色谱法
Determination of Vitamin D2 and Vitamin D3 in Cosmetic by High Performance Liquid Chromatography
发布日期：2018-06-12
实施日期：2018-07-12
发布单位：山东省质量技术监督局

前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由山东省质量技术监督局提出。本标准由山东化工标准化技术委员会归口。
本标准起草单位：山东省产品质量检验研究院、山东福瑞达生物工程有限公司。本标准主要起草人：朱海荣、焦毅、商娜姗、田静、刘金风、王灵玺、王东岳、刘鹏飞、赵丽芳、周莉莉、姜金华、张娟、杨素珍。

1 范围
本标准规定了化妆品中维生素D2、维生素D3的高效液相色谱法，本标准适用于化妆品中维生素D2、维生素D3的检测。本方法取样量为0.5g时，维生素D2检出浓度为3.6mg/kg，最低定量浓度为10mg/kg。维生素D3检出浓度为1.8mg/kg，最低定量浓度为5mg/kg。

2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法方法提要

3 原理
3.1 维生素D2和维生素D3在265nm处有紫外吸收，可用反相高效液相色谱法分离，并根据保留时间和紫外光谱图定性，外标法定量。
3.2 试剂和溶液除另有说明外，所用试剂均为色谱纯，水为GB/T6682规定的一级水。

4 试剂和材料
4.1 甲醇。
4.2 乙腈。
4.3 维生素D2：纯度≥99.0%。
4.4 维生素D3：纯度≥99.0%。
4.5 混合标准储备溶液：分别准确称取维生素D2 0.1000g及维生素D3 0.2000g，移入100mL容量瓶中，用甲醇（4.1）溶解并定容至刻度，摇匀，作为标准储备溶液。避光保持，保存期不超过2周。

5 仪器与设备
5.1 高效液相色谱仪：紫外或二极管阵列检测器。
5.2 紫外分光光度计。
5.3 超声波清洗器。
5.4 分析天平：感量0.0001g。
5.5 有机相微孔滤膜：0.45μm。

6 分析步骤
6.1 样品预处理
称取样品约0.5g（精确至0.0001g）于10mL具塞比色管中，用流动相定容至刻度，摇匀，超声提取30min。经0.45μm有机相微孔滤膜过滤，滤液作为待测样液。
6.2 色谱参考条件
6.2.1 色谱柱：C18柱，250mm×4.6mm，5μm
6.2.2 检测器：二极管阵列检测器。
6.2.3 检测波长：265nm。
6.2.4 流动相：甲醇+乙腈=90+10（HPLC分析前，经0.45μm滤膜过滤及真空脱气）。
6.2.5 流速：1.0mL/min。
6.2.6 进样量：10μL。
6.2.7 柱温：室温。
6.2.8 其它能够达到同等分离效果的色谱条件均可使用。
6.3 标准曲线的制备
6.3.1 纯度校正
由于维生素D2和维生素D3对光不稳定，因此在配置标准溶液之前需用紫外分光光度法进行纯度校正，方法如下：维生素D2和维生素D3在263nm波长处有最大紫外吸收，而乙醇在该波长无吸收。95%乙醇溶液中，质量分数为1%的维生素D2溶液的吸光系数ε1%为460，质量分数为1%的维生素D3溶液的吸光系数ε1%为485，吸光系数相当于吸光度/浓度，因此通过测定吸光度可得出所配置溶液的准确浓度，进而校正纯度。维生素D2和维生素D3的纯度按照式（1）计算：
P = (A × 100) / (C × L × ε1%)
式中：
P为维生素D2、维生素D3的纯度，%；
A为维生素D2、维生素D3的吸光度，单位为毫克每升（mg/L）；
C为维生素D2、维生素D3的质量分数，%；
L为比色皿的光径，单位为厘米（cm）；
ε1%为维生素D2、维生素D3的吸光系数。
6.3.2 标准曲线的绘制
(1) 分别准确移取一定量维生素D2和维生素D3的标准储备液（4.5），用流动相将标准工作溶液中稀释成一系列浓度的标准溶液，其中标准溶液中维生素D2的浓度分别为200mg/L、100mg/L、80mg/L、50mg/L、20mg/L、10mg/L，标准溶液中维生素D3的浓度分别为400mg/L、200mg/L、160mg/L、100mg/L、40mg/L、20mg/L。按照浓度由低到高的顺序依据色谱条件（6.2）分别测定，以标准工作溶液浓度为横坐标，相应色谱响应值为纵坐标，绘制标准曲线。