【地方标准】 水稻白叶枯病菌检验鉴定技术规程

水稻白叶枯病菌检验鉴定技术规程 DB51/T921—2009 前言 本标准由四川省农业厅植物检疫站负责起草，主要起草人包括赵兰鸽、陈素清、帅波、吴志平、李毫、袁曦、万佳等。 1 范围 本标准规定了水稻白叶枯病菌的取样方法、田间症状识别、实验室检验鉴定技术要求，适用于水稻白叶枯病菌的检验和鉴定。 2 术语和定义 2.1 水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）：引起水稻白叶枯病的病原细菌，属于黄单胞杆菌属细菌。 2.2 噬菌体（prophage）：是一种感染细菌和放线菌的病毒，特指侵染水稻白叶枯病菌的病毒。 2.3 噬菌斑（plaque）：在培养基的菌苔上，因噬菌体裂解细菌而形成的半透明空斑。 3 原理 水稻白叶枯病菌通过带菌种子传播，且难以获得纯培养，鉴定较为困难。因此，在鉴定时，除了田间症状识别外，主要采用噬菌体检测和酶联免疫法（ELISA）。噬菌体检测原理是利用噬菌体的寄主专化性，通过噬菌斑判断样品是否带菌。酶联免疫法通过抗原和抗体的特异性免疫反应，利用酶催化反应生成有色产物，判断样品是否带菌。 4 试剂与材料 4.1 ELISA检验 4.1.1 样品提取液：取1.15g磷酸氢二钠（Na2HPO4）、0.2g氯化钾（KCI）、0.2g磷酸二氢钾（KH2PO4）、8g氯化钠（NaCl）、0.2g叠氮化钠（NaN3），用1000mL蒸馏水溶解，并调整pH至7.4。 4.1.2 洗涤液：取1.15g磷酸氢二钠、0.2g氯化钾、0.2g磷酸二氢钾、8g氯化钠、0.5g吐温20，用1000mL蒸馏水溶解，调整pH至7.4。 4.1.3 封闭液：取5g无脂奶粉，用100mL样品提取液溶解。 4.1.4 包被液：取2.93g碳酸氢钠（Na2HCO3）、1.59g氯化钠、0.2g叠氮化钠，用1000mL蒸馏水溶解，调整pH至9.6。 4.1.5 抗体稀释液：取2.5g脱脂奶粉，加入100mL洗涤液溶解。 4.1.6 抗体：水稻白叶枯病菌抗体，按市售产品要求进行稀释。 4.1.7 酶标抗体：市售碱性磷酸酶标记的羊抗兔抗体。 4.1.8 底物缓冲液：用80mL灭菌蒸馏水将0.01g氯化镁、0.02g叠氮化钠、9.7mL二己醇胺溶解，调pH至9.8，定容至100mL。 4.1.9 底物溶液：将5mg对硝基苯磷酸盐溶解于5mL底物缓冲液中，避光制备。 4.1.10 终止液：将12g氢氧化钠溶解于100mL蒸馏水中。 4.1.11 肉汁冻培养基：取3g牛肉浸膏、1g酵母浸膏、5g蛋白陈、10g葡萄糖、15g琼胶，用1000mL蒸馏水溶解，调整pH至7.0-7.5。 5 仪器及用具 小型粉碎机、恒温箱、酶联板、微量移液器、手持放大镜、显微镜等。