【农业行业标准(NY)】 转基因植物及其产品检测大豆定性PCP方法

本标准由农业部科技教育司老出。前言
NY/T675—2003
本标准起草单位：中国农业大学、上海市农业科学院、中国农业科学院生物技术所、农业部科技发展中心.
木标准主要起带人：罗么波、出屋仑张人兵，贾常彭于发，金恶平，李宁、往其怀。本标准首次发布。
1范围
NY/TG75—203
转基因植物及基产品检测大豆定性PCR方法本际准现定：转基内大豆及其产品的定性FCR检测力法。本标准适氏于转茶四单廿游人出及其产品、转基固抗草下牌大豆设其产品、转因高袖酸大以及其产品·包控大种子、大豆、豆拍、大豆粉大豆池及具像人制品中转基因成分的定作1R检。2规范性引用文件
下列文性的条款适过本杯的叫用而成为木标准的案款。凡是在口期的引册义件，其随所有闪修改单（不位括动误的内客）或修订版均不适用二本标准，然，鼓励根据不标曲达成协议的各方谢究是可使用这些文外的最新版本，凡是不注口期的引用交件，其最新版木适合本标准。NY/Y572转垂因核物&其产与检创道用要求NY/TS74转闪柏物及其产5挖测13NA禁必和纯化3原理
手对转内卓廿时V44032)含有的以V55启动终.了绣率牛花节CTP4、C-热基因以及人内款准基因ec，改计持引物志行PCR扩增.以投测式详中是舍有特基岗航草H脚大豆的成分，转基内抗草！群大和转基因高油酸大豆含有其同的元件CaMV3S启动子基因以及内标谨基国·用上连的引物进行R扩广治以检测试样中层否含轨基国抗草苹丁群大豆和转求国高汕酸大豆的成分.
4试剂与材料
除非与有说明，在分析中仅使用分析纯试剂：配制好的落液终商源次菌后使用。4.1各1)mul/L的回种脱其恢快核廿醛（dAIP,dcTGT1d=TP混合济滋。4.2[0mml/T.载化钠籍液：称取氢年化销80多先用10ml.水降解已，再加水定穿到20。4.30C的mol/L7.二股四乙酸一盐（EDTA落液：除取乙胺四哦一纳13.g门人I中，再加入JUmo1/.氛化钠落滤，热渐后、冷部室温，件Inl/T，车化销拓液调：H至.0用水定容到11mL在103.4kP灭2Cm.n4.45c×AF单冲液：你取Trix247.2，先用300mL水加热伴落率，期:00ml.500mmol/LKIYIA的术落液（HB.0)片冰乙调I至&.G热后用水定穿Il.4.5TaqDNA聚合酶（3单停/l.)及1C1CR反应线外（含25nmal/IMg）4.G0mR/.1.滚化乙锭辫浓
注：漠化乙铭（H有致准作川·使川H典次世手，4.7DNA分子盘标记(DNAMleclarWeigh Markea)4.81ml/LTrsHCl1ml/1.Tr-HC(H8.)I0mL5CUmmo./LErA(pH3.0)滴2ml用定弃1000L
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4.10样冲液：称取滨耐蓝25mg加水13mL室温下送假弃；再移二中率前蓝250m，ml.水带解；称取萨赫50与用30l水等新，合并三种液，用水定容至100mL，在4中保存。4.11外物
4. 11, 1e基国。
J.--.F?:$:GECGTCTACTCEACCCCCATEC:Ie-RI.E GCCCATCTGCAAGCLTTTTGT':预期扩资片股为13。
4.11.235S-CTP4 因
SC-FI:FTEATGTGATATCTXACTGACG3ES-RI,5:TGTATCCCTIGAGCCATGTTGT3'碳期扩带片股为172.
A.11.3C-ps。
GW-FI?*CCTTCATTTCGGCGGTCTEG3:CE-RI S'GCGTCATGATUGGCFCGAIG:预期片4
4.11,4n终止子因。
PIUS-FI&'GAATCCTGTTGCCGGTCTTG3',PnS-R1:TTATCCTAGFTTGCGCGCTA3:低期扩片段18Cbp
4.17,5a5S拍动手推再。
3SS-FSCTTACAAATGCCATCATTGC3,3SS-R.SGATAGTGGGATTGIKXGATCC&期护段155p
4.12引率减：TE规液H8.01分期将上述引物帮释到：m1,1.4.13PC农产物间收试剂盆：按便用说脏接作。4. 14限性内醇Xnn:[效血油胶
4.15台错洲。
5使器
5.1通常实验范没器设备：
5. 2FCR仅.免费标准bzxz.net
5.3电承位
5.4豁外透射改。
5.5凝较成像系统或照相系统
五.6蛋蒸馅水仪：
6操作步罩
6. 1 TNA棋板的制备
按NY/T674的定制备试样，GMO阳对照和GMO期性对照的DNA模板。6.2PCK反应
6.2.1试样的PCR反应
在成反废管中依次人X暖冲范5各10l/能列脱氧核控酸dAdCG强合资液物落液（含下游司场各【、或样3
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版合报爆的月盘蒸水
拉体送致50。再的55上1.石端游（燃尝设的PCR仪可以不加石蜡猫，年个试样次。
以4200/mn离心15后，将P管拥人1Ck仅中，95温5min进行a5次扩增反应循环95通30958C恒遇352值摄30然79微湿Ymi限出PR友座.对应应产进行电球检激求在下保存。
S.2.2对的CR反率
在欧样ICR发庐的商时，应投量GM)阴性对所、GMC)日性对期和范月对照，GMD性对照是指用手转科因大记材料中摄取的NA作火CR反应休系陈NA模板：M股性对照尼格用特基医大支对科中摄取的R为R反成传系的模板室照是基用苑菌盘蒸水作另ICR应整体系的DNA榜板。上述对照PCR反应体系乎除模板外其录期分与，2,1据网
6.3PrK严物的电泳龄测
将读重转胎带那人TAE婴冲薇中，加热格其落源，配制成项脂墙浓变为2的率液，然后按每1球随糖游商中证人海化乙键落液收比例，人消化乙落微，妮处箱透冷部后将其促人电泳短上室摘下换臣放凝啦后，放人1AE级冲商中，在每食脉过中那人7.三L的FR产物（离和样缓冲乘视合）其守-个泳道中人DN入分子量标记.接瓶电源进行电球。6.4避般减像分析（期相）
宅渔装束后，将琼踏装收整于凝联成像仅上或版外温经上成激。根景外NA分子量示识到断扩密出的可的条带的大小，将电泳结果形最电平文性存期实消报围系势按。6.5PK产物的回收
M！PCR反应满与上杆领冲浓泥台后，加人频制好的含%谅脂糖凝股的泳道中，性其中的一个流造中氧人LDNA分平盘标记，接递也源进行电泳。宾会步减教PCR产购腾收试剂益说明选行。6.6心R产够的酸切密定
Ca动子扩诺产物ss，可以被限性内雕m成大小为和115bp的两个片段，具怀操作为：取15l.回收的P心产物放人到管中，加人1[的限制性内规前Xmt再属人2r反切反垃规冲饿，规水2l配成2反应体系在7℃包湿水浴保湿没应h，格20反成费上样缓冲滚深台房低预制好的含2.5%滚脏雄的·个述送中按6.3列84收摄期作进行分折！
结分榜和表述
7.您聚在试举乐MO阳件对的C友忘中，CMV5S房效平，0s路止了，心paM治动子漆体转移脏基魔片段（CaACTP版及内标准e这基应舒费到T于增：且扩增片段与预期片段一致，而在GM心阅性对照它衣扩增出ec基因片段，充白对照中盘有：何带片段，表明该格品为阳性结米，出了CeMVS启动装网、、警：了盗因、5S启动子版升绿外转够放载医片段（u钢354）筑草计牌基内。果就群G件对限的CR友aMVS启物子你内标维送降个蒙医部到T扩增，且护增片段尚两期片段一数而在心用性对照中仅扩增出函片段，户对瓶经有行何扩增片投在对试样的性价S启动扩片段的醇可版策中，增片段可以最均成和115两个片股，表明该样品限能装果给自MV355定动子睾。2果在然详就GMC闲性照的胶麻恒有片良扩增：MO解性照CMS自动子、考止子，C，CaM35SCTP以及树都得刻抢增，室白对熊中改有例注增片较：表明滚样品为阴性站采本检MS启动、0s终止产，CM资S-TP4NY/T 75--2003
草群医。
果车试样和M的反应中，仅有e基片段得到扩增：GM阳性照中S启动了和em贝部得到扩增凹对照中没有仟向扩增儿段，表明该样品为结果：检山广M品启动于基因。
7.3如果在试M）阳性对照和M)防性对照FR反宽中.eti基内片段均不得到扩培，税明净A模极制务率1R求应休系户的荣个环价存在可超.需查找原益新检如果在CM)院性对照PCR反底中除本贝得到扩治外，还有其他外源四得到扩塔或者空当对照中扩增出了产物片段，则说明检划过程中发生了污染，需查找原因重新检测。
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