【农业行业标准(NY)】 转基因植物及其产品检测DNA提取和纯化

本标准由农业帮科技教育司提出。前
NY/T674—2003
本标准起章单位：中国农业科学院生物技术所，中国农业学院植物保护研究部、上海市农业科学院农业部科技发展中心，中回发业大学.本标准主要起草人贾七荣、金军、张大兵，彭于发、黄民仑、李宁注其怀、罗云波。牛标准首次发布。
1范围
转基因植物及其产品检测
DNA提取和纯化
本标准规定丁转基固档物及其产品巾DNA提取和纯化的方法和接术要求。本标准适用丁转基因格物及其产品中1NA的提取和纯化。2规范性引用文件
NY/T 674—2003
下列文件中的案款通过本标证的可用而成为木标准的条款。无是注口期的引用文件，其随后所有的候改单（不位活勘误范内容》或修可版均不适用于本标准，龄仙，鼓随根据术标准达成协设各方研究比否可使这费文格的最新版本，凡足不注H期的引用文件，其最新版本适用于本标准.NY672转基州植物及其产H检测通用要求NY/T63转.四植物及共产品格测拥样3原理
通过物理和化学方法使DVA从品的不同组分中分离山米，利用不同的纯化方法，弃除样品的生口厌.脂贴，多轴及其池次生代谢物.及LKA提收过程中加人的三惠甲烷、异戊醇、异丙醇，乙醇利乙曦等：状得纯化的NA
4试剂与溶流
除非另有说明.在分折中仅快用分析纯试剂配制好的清液经高温灭菌后他用4.1池代十A烧基二甲胺（cetyllrimethylammoniumbromide,CTA）.4.2二经甲基氯甲完[trishydraxymerhy!）aminomethane，Tris]4.3—水乙胺乙二纳(rihyletwdiarine teraacetie Ecid,disodium sal，dikydrate.EDrA-Na2H,0>
4.4K蔬基乙欧(Etitrcaptuethanoi)。45三瓶币烧（calorafarm），
4.6异成醇tisonyalcohol)
4.7分丙醇(isnprpylahilol)
4.B一摄中境1片底醇=24+1（体界比>，4.9了6乙醇奔腋：收750m无水乙醇，加水定容柔1.4.1070%乙醇落液取700ml.水7.，加水足容至1L，4.11TA提取凝净液1配制每升CTA报取想冲液I，通在8C0mL去断了水加人15.化钠.密动容%快落质完全解.然后加.人5UmL1mol/LTrisHCl(pH8.0)[在%00mL再子水中率解121.1g一羟甲差氮基中境（Ttig),冷坏室后用浓盐酸调游液的pH至8.6约需42ml.涨盐）.水定等车1，分装片高火菌,20ml.0.5ml/T，EDTA（H.）生800mL水中入186.二水乙二胺四乙题二销（EI\ANaHO)，弃破境拌器上别烈换拌，用氢氧化钠NOH」
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谢节落液的II值至8.（约需2氛氧化钢瓶粒)然后定容至1L分装后高压灭菌,用水定容至1T.分装后产民灭荫。
4.12CTAB提取微冲液Ⅱ：比制每升（TAB提敢缓冲浪1应在8001ml.去离了水中加人46.75款化纳2)g演代1人烷基三用（CTAB)、据动客露便搭质完全穿解，然后证人1mo)/LTris-HCI(pH8.0)b)mU.5w/LEI)TA（H8.)20I用水定容全1.分装商三灭菌。4.13乙酸钠溶液：配制每刀乙酸钠深液盘在300ml.水中落解439.1一水乙酸剂用冰乙酸节H但至5.2,加水定容坐1L,分装后压灭曲4.14RNaseA.将10mg暖RN1酷路解于9871.水中.然后加人！moi/LTrigHC1pH7.511Url二在800ml.去离子水溶解12.1x三整中基氮薪甲烧（Trs>，加人60ml.浓盐酸，冷部至室温后调节II值至7.5.加水定穿至11.分装后高k火菌].mol/l.氟化钩3gL[在2001m].水中落解292.2g化钠，加水定容至」L，分装后高压火菌），于100水浴中保温15mn.缓慢冷却至室温分装战小份保存20℃
4.15TF深冲液，配制每升TF爱冲液，应在900mL水中依达加i人1mol/LTris-HC:I(pH.0）1omLU.5l/I.FTTA（TTR.0>2mL,加水定容11..分装后商压灭菌。5收器和设备
5.1通带实峻字器设备。bzxz.net
5.2高速玲冻离心机(12mlr/min。5.3高速台式商心机12crmim，
5.4崇外分光光度计
5.5磁力找半器.
5.6商后灭荫锅。
6试验方法
6.1岱样的预处理
6.1.1固态试样待检拍固车试酬磨虑积状，题粒的人小在之m血以下。6.1.2非油脂类液态试件，如而酱等站周状度品可直接用于DN的提取。酱油、豆奶、番葡替等液态划工品可取50L以上式详（根据不同试样和不同控测要求，可以适当增加试样盘）.经1000/iT离心1Cm.n，办去上消液，保留沉淀用TTNA的抽带，或者30V加热蒸发水分后，取千物质用于DVA提取；或省在冷冻+燥后，取下物员用下DNA提吸。6.2NNA的提取与纯化
6.2.1CTAB法据取DNA
将10Cm&经预处限的试样，在液氢中充分研磨成粉末后加人400ul.冰上预冷的CTAB提取缓冲滴「中（不需研磨的试样直换加人），加人50065C张热的（TAB提取缓冲波Ⅱ，1μT.2-靠基乙醇满，65保祖30minmin其间不时轻领点创混勾。持冷却至室温后人51.RNaeA扩液室温下放量min。加人450l.三氧中烧异宽醇，整缓期例据划潜液。120t/min声心m1n至办明。将上清度转移单下净的离心管中，依次人的.升丙醇应50乙醇钠落液，轻混题例混勾。2000/nin高心1min。齐上清薇，加人R0077.晚，12000r/min离心5min充上清后加人Lo)μl.70%乙醇洗象沉滨：12c0r/mia离5min，弃上满减。除去戏留的乙降，持沉落卡姆后，TNA沉淀游率于100，1E河液，一20保行务用。6.2.2油脂类加工品1N4提取
取油器食品适量（液念泊取3mT磷脂美和固态油脂版5）改人25Um一角瓶中.加人25ml止已烷，于磁力搅封器上不断探满魂含2h后，加入25ml.CTAB提敢毁冲液Ⅱ，维下磁力觉弹器上NY/T 674—2003
源谨德全2h，将游密转入19m高心管中，于80c0/mm离心1ia，使有租期和水树分离，取次相，人与水落液等体的承丙醇及水拍溶液1/10本积的乙要销箱获，轻爱两阅混匀，室温放望10min店：12C3Jt/min离心10mu，弃上清滤，待沉境下操后用200LTE线冲液落解沉淀.加人800μT,三氯甲烷一分化醇轻燃题勾，120901/min离心2mn孕分相，将上清液转移至千净的离心管中，均人亨游液等体积的异内醇及萃液1/1D体织的之销落没，轻慌期钢混勾。室湿放置10Tain后.12050/mn两心10min。弃上净液后，依次加人800l.7G之群霜200L70%乙醇统亲统淀12tr/min离心5nin.弃除乙醇箱液，待流滨工燃与DNA沉淀溶解于100μLTE缓冲饿中，一0保存备用。
6.3NA磨嵌纯度的定和保存
将DN适当错帮，测定并记录其在60和380m的素外光吸改收，以-个（DM值根泻于50/NA浓度来计算化的NA装度，要求NA效2/D的在.-0之间.依据得得的微度将DNA将稀释到25ag/-50g/l.—0保存注：出于基因DYA本宜及复家融，国此坐议对需经常使用的DA需要分，置存格，需要使用司收融化店应资立明丧用，使用结束后制余的DN量存体筛妞期保存，存成对问不以醒证11，
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