【农业行业标准(NY)】 鸡马立克氏病强毒感染诊断技术

ICS11.220
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 905-2004
鸡马立克氏病强毒感染诊断技术Diagnostic technique for virulent marek's disease virusinfectionof chickens
2005-01-04发布
2005-02-01实施
中华人民共和国农业部
本标准的附录A和附录B都是规范性附录本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：安徽技术师范学院。本标准主要起草人：张训海、朱鸿飞、吴延功、张忠诚、陈薄言。NY/T905—2004
1范围
鸡马立克氏病强毒感染诊断技术NY/T905-2004
本标准规定了马立克氏病病毒（Marek'sdiseasevirus，MDV)琼扩抗原和MDV琼扩抗体同时检测进行鸡MDV强毒感染诊断的两种操作方法。本标准适用于鸡马立克氏病（Mareksdisease，MD）临诊鉴别诊断、MD流行病学调查、MDV强毒感染的诊断、鸡群MDV强毒污染监测、产地和口岸检疫。2MD琼脂免疫扩散试验检测技术与方法该技术与方法适用于14日龄以上鸡的羽毛囊（含髓羽毛根或羽液）MDV抗原和30日龄以上鸡的血清或羽髓液中MDV特异抗体的检测。2.1材料准备
2.1.1器材：1mL注射器及9号针头：1.5mL离心管：微量移液器及移液器吸头：尖头眼科摄和手术剪：孔礼径3mm的孔器
2.1.2MDV特异琼扩阳性抗原和琼扩阳性抗体：按说明书保存与使用。2.1.3琼脂凝胶平板的制备：见附录B2.2操作方法
2.2.1羽液MDV抗原和抗体的同时检测法2.2.1.1羽液样品的制备
从被检鸡股腔外侧胸部和背颈交界处羽区及翅羽，采集较租大的富含羽髓的羽毛根3根～10根。挤压出羽髓于1.5mL离心管中，离心分离出羽液，作为试样直接检测或置于一20℃下待检2.2.1.2打孔bzxz.net
将已制备的琼脂凝胶平板放在预先画好的如图1所示的7孔梅花型图案上，用打孔器垂直打孔，相邻孔孔边距均为3mm。用9号针头小心剔除孔内凝胶，勿损坏孔的边缘，避免凝胶层脱离平板底部。视琼脂凝胶平板面积可同时做多个梅花型孔。2.2.1.3封底
图17孔梅花
型图案
用酒精灯火焰烧烤该处平板底至约70℃（可以用手腕皮肤感受至不能承受为止），以防样品溶液从孔底侧漏。
2.2.1.4加样
用微量移液器分别在外周中的2号3号5号、6号孔，分别加注4份被检样品；向1号4号孔加注MDV特异琼扩阳性抗体/抗原。向中心孔内加注与1号、4号孔相对应的MDV特异琼扩阳性抗原/抗体。以上孔均以加满不溢出为度。每加一个样品，应更换一个吸头。2.2.1.5感作
将加样完毕的琼脂板加盖后，随即进行标识与记录，而后将琼脂板轻轻倒置平放在湿盒内，置于37C温箱中感作，24h内观察并记录结果2.2.2羽毛根及血清MDV抗原和血清MDV抗体的同时检测法2.2.2.1样品的制备
NY/T905—2004
被检鸡的羽毛根样品和血清样品应同步采集。2.2.2.1.1羽毛根样品：从被检鸡股腔外侧、胸部和背颈交界处羽区或翅羽拔取较细小的富含羽髓的羽毛根，剪下0.5mm长的羽毛根尖，每个试样2根～3根即可，直接用于MIDV抗原的检测或置于-20下待检。
2.2.2.1.2血清样品：从被检鸡翅静脉/心脏抽取不少于0.2mL血液，注人1.5mL离心管，待血液凝结后使之自然析出或离心分离出血清，直接用于检测或置于一20℃下待检。2.2.2.2羽毛根MDV抗原检测
将已制备的琼脂凝胶平板放在预先画好的7孔梅花型图案上，用打孔器垂直打出中心孔。在中心孔周围6个孔的中心，用尖头眼科摄的摄尖或牙签分别垂直插2个～3个紧密的孔眼。每号孔依次插人同一被检鸡2个~3个羽毛根样品。如此，每个中心孔周围可检测6份样。酒精灯火焰封底后，冷却至室温。向中心孔内加注MDV特异琼扩阳性抗体，以加满不溢出为度。加盖与标记后，将平板倒置平放在湿盒内，置于37℃温箱中感作，24h内观察并记录结果。2.2.2.3血清MDV抗体的检测
操作方法同2.2.1，其区别是在加样时，2号3号，5号、6号外周孔中依此加注4份被检血清，1号4号孔加注MDV特异琼扩阳性抗体，向中心孔加注MIDV特异琼扩阳性抗原。2.3结果判定及判定标准
被检样品MDV抗原和MIDV抗体的检测，任何一种出现阳性结果或2种都出现阳性结果，则判被检样品鸡为MDV强毒感染阳性；都呈阴性者，则判为被检样品鸡无MDV强毒感染。2.3.1被检样品孔或羽毛根与相邻的已知阳性抗体孔或阳性抗原孔之间形成一条清晰的沉淀线，并与已知阳性抗原孔和阳性抗体孔的沉淀线末端相互融合者，则判被检样品为阳性。2.3.2被检样品孔或羽毛根与相邻的已知阳性抗原孔或阳性抗体孔之间都不出现沉淀线，而已知阳性抗原孔和阳性抗体孔之间有明显的沉淀线，则判被检样品为阴性。2.3.3介于阴性、阳性之间者判为可疑，应重新采样复检。若仍为可疑，则判为阳性。2
附录A
【规范性附录】
溶液的配制
A.1pH7.0~7.40.01mol/L磷酸盐缓冲液的配制磷酸氢二钠（NaHPO-12H,O）
磷酸二氢钾（KH,PO4）
氯化钠(NaCl）
将上述试剂依次加人容器，用去离子水或蒸馏水溶解后定容至1000mLA.2
2%叠氮钠溶液的配制
叠氨钠（NaN）
蒸馏水
溶解后置100mL瓶中盖塞存放备用。NY/T905—2004
NY/T905—2004
附录B
（规范性附录】
琼脂凝胶平板的制备
量取pH7.0~7.4的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液（附录A中A.1)100mL，加人氯化钠8.0g、琼脂糖或优质琼脂粉1.0g，配制成含8%氯化钠的1%琼脂糖或琼脂溶液，8磅10min高压或水浴加热使其充分融化，加人2%叠氮钠（附录A中A.2)1.0mL，混和均勾，冷却至60℃~65℃时，倾注于洁净干燥灭菌的培养皿中，使平置后的液面高约3mm，加盖待室温下冷却凝固后，倒置放人湿盒（湿盒用含消毒液的纱布铺底），密封后置于4℃条件下保存备用（时间可达2个月以上）4
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