【国家标准(GB)】 食品卫生微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验

GB 4789.6—1994
中华人民共和国国家标准
食品卫生微生物学检验
致泻大肠埃希氏菌检验
Microbiological examinationoffoodhygieneExamination of diarrheogenicEscherichia coliGB4789.6—1994
主题内容与适用范围
本标准规定了食品中致泻大肠埃希氏菌的检验方法。本标准适用于食品和食物中毒样品中致泻大肠埃希氏菌的检验。2引用标准
GB4789.28食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂3设备和材料
3。1平天：称取检样用。
3.2均质器或乳钵。
3.3温箱：36±1℃，42℃。
3.4水浴：100℃，65~68℃，50℃。3.5
显微镜。
离心机。
酶标仪。
细菌浓度比浊管：MacFarland3号。灭菌广口瓶：500mL。
灭菌三角烧瓶：500mL，250mL。灭菌平皿：90mm×15mm。
灭菌试管：10mm×75mm。
灭菌吸管：1mL，5mL。
橡皮乳头。
载玻片。
酒精灯。
灭菌金属匙或玻璃棒。
接种棒，镍铬丝。
试管架，试管篓。
冰箱。
注射器0.25mL，连接内径为1mm塑料小管一段。3.22
灭菌的刀子、剪子、镊子。
小白鼠：1～4目龄。
硝酸纤维素滤膜150mm×50mmΦ0.45um。临用时切成两张，每张75mm3.24
X50mm，用铅笔划格，每格6mm×6mm，每行10格，分6行。灭菌备用。4培养基和试剂
4.1乳糖胆盐发酵管：按GB4789.28中4.9规定。中华人民共和国卫生部1994—03—18批准1994—09—01实施
GB4789.6—1994
4.2营养肉汤：按GB4789.28中4.8规定。4。3肠道菌增菌肉汤：按GB4789.28中4.18规定。麦康凯琼脂：按GB4789.28中4.24规定。4.4
伊红美蓝琼脂（EMB）：按GB4789.28中4.25规定。三糖铁琼脂（TSI）：按GB4789.28中4.26，4.27规定。克氏双糖铁琼脂（KI)：按GB4789.28中4.28,4.29规定糖发酵管（乳糖、鼠李糖、木糖和甘露醇）：按GB4789.28中3.2规定。4.9赖氨酸脱羧酶试验培养基：按GB4789.28中3.12规定。4.10
尿素琼脂（pH7.2）；按GB4789.28中3.16规定。氰化钾（KCN）培养基；按GB4789.28中3.16规定。蛋白陈水、靛基质试剂：按GB4789.28中3，13规定。半固体琼脂：按GB4789.28中4.30规定。Honda氏产毒肉汤：按GB4789.28中4.34规定。4.14
E1ek氏培养基：按GB4789.28中4,35规定。4.15
氧化酶试剂：按GB4789.28中3.18规定。4.17
革兰氏染色液：按GB4789.28中2.2规定。致病性大肠埃希氏菌诊断血清、侵袭性大肠埃希氏菌诊断血清、产肠毒4.18
素大肠埃希氏菌诊断血清、出血性大肠埃希氏菌诊断血清。4.19产肠毒素大肠埃希氏菌LT和ST酶标诊断试剂盒。4.20
产肠毒素LT和ST大肠埃希菌标准菌株。抗LT抗毒素。
4.22多粘菌素B纸片：300IU，Φ16mm。4.230.1%硫柳汞溶液。
4.242%伊文思蓝溶液。
5检验程序此内容来自标准下载网
致泻大肠埃希菌检验程序如下：中华人民共和国卫生部1994—03—18批准1994—09—01实施
GB4789.6—1994
6操作步骤
6.1增菌
样品采集后应尽快检验。除了易腐食品在检验之前应预冷藏外，一般不冷藏。以无菌手续称取检验25g，加在225mL营养肉汤中，以均质器打碎1min或用乳钵加灭菌砂磨碎。取出适量，接种乳糖胆盐培养基，以测定大肠菌群MPN，其余的移入500mL广口瓶内，于36士1℃培养6h。挑取1环，接种于1管30mL肠道菌增菌肉汤内，于42℃培养18h。6.2分离
将乳糖发酵阳性的乳糖胆盐发酵管和增菌液分别划线接种麦康凯或伊红美蓝琼脂平板；污染严重的检样，可将检样匀液直接划线接种麦康凯或伊红美蓝平板，于36土1℃培养18～24h，观察菌落。不但要注意乳糖发酵的菌落，同时也要注意乳糖不发酵和迟缓发酵的菌落。6.3生化试验
6.3.1自鉴别平板上直接挑取数个菌落分别接种三糖铁琼脂（TSI）或克氏双糖铁琼脂（KI）。同时将这些培养物分别接种蛋白陈水、半固体、pH7.2尿素琼脂、KCN肉汤和赖氨酸脱羧酶试验培养基。以上培养物均在36℃C培养过液。6.3.2TSI斜面产酸或不产酸，底层产酸，H,S阴性和尿素阴性的培养物为大肠埃希氏菌。TSI底层不产酸，或H,S、KCN、尿素有任一项为阳性的培养物，均非大肠埃希氏菌。必要时做氧化酶试验和革兰氏染色。6.4血清学试验
6.4.1假定试验：挑取经生化试验证实为大肠埃希菌的琼脂培养物，用致病性大肠埃希氏菌、侵袭性大肠埃希氏菌和产肠毒素大肠埃希氏菌多价0血清和出血性大肠埃希氏菌0157血清做玻片凝集试验。当与某一种多价0血清凝集时，再与该多价血清所包含的单价0血清做试验。致泻大肠埃希氏菌所包括的0抗原群见表1。如与某一单价0血清呈现强凝集反应，即为假定试验阳性，表1致泻大肠埃希氏菌所包括的0抗原群大肠埃希氏菌的种类
055086
0128ab0142
所包括的0抗原群
o11lab
0112ac
0125ac0127
01350136
0606011015
5027063
0128ac
01140115
01590166
6.42证实试验：制备0抗原悬液，稀释至与MacFarland3号比浊管相当的浓度。原效价为1：160~1：320的0血清，用0.5%盐水稀释至1：40。稀释血清与抗原悬液在10mm×75mm试管内等量混合，做单管凝集试验。混匀后放于50℃水浴箱内，经16h后观察结果。如出现凝集，可证实为该0抗原。6.5肠毒素试验
6.5.1酶联免疫吸附试验检测LT和ST。6.5.1.1产毒培养：将试验菌株和阳性及阴性对照菌株分别接种于0.6mLCAYE培养基内，37℃振荡培养过夜。加入20000IU/mL的多粘菌素B0.05mL，于37℃1h，离心4000r/min15min，分离上清液，加入0.1%硫柳汞0.05mL，于4中华人民共和国卫生部1994—03—18批准1994—09—01实施
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C保存待用。
6.5.1.2LT检测方法（双抗体夹心法）：（1）包被：先在产肠毒素大肠埃希氏菌LT和ST酶标诊断试剂盒中取出包被用LT抗体管，加入包被液0.5mL，混匀后全部吸出于3.6mL包被液中混匀，以每孔100uL量加入到40孔聚苯乙烯硬反应板中，第一孔留空作对照，于4℃冰箱湿盒中过夜。（2）洗板：将板中溶液甩去，用洗涤液I洗3次，甩尽液体，翻转反应板，在吸水纸上拍打，去尽孔中残留液体。（3）封闭：每孔加100uL封闭液，于37℃水浴中1h。（4）洗板：用洗涤液I洗3次，操作同上。（5）加样本：每也分别加各种试验菌株产毒培养液100uL，37℃水浴中1h。（6）洗板：用洗涤Ⅱ洗3次，操作同上。（7）加酶标抗体：先在酶标LT抗体管中加0.5mL稀释液，混匀后全部吸出于3.6mL稀释液中混匀，每孔加100uL，37℃水浴中1h。（8）洗板：用洗涤液Ⅱ洗3次，操作同上。（9）酶底物反应：每孔（包括第一孔）各加基质液100uL，室温下避光作用5～10min，加入终止液50uL。（10）结果判定：以酶标仪在波长492nm下测定光度OD值，待测标本OD值大于阴性对照3倍以上为阳性，目测颜色为桔黄色或明显高于阴性对照为阳性。6.5.1.3ST检测方法（抗原竞争法）：（1）包被：先在包被用ST抗原管中加0.5mL包被液，混匀后全部吸出于1.6mL包被液中混匀，以每孔50uL加入于40孔聚苯乙烯软反应板中。加液后轻轻高敲板，使深布满孔底。第一孔留空作对照，置4℃冰箱湿盒中过夜。（2）洗板：用洗涤液I洗3次，操作同一。（3）封闭：每孔加100uL封闭液，37℃水浴1h。（4）洗板：用洗涤I洗3次，操作同上。（5）加样本及ST单克降抗体：每孔分别加各试验菌株产毒培养液50uL，稀释的ST单克隆抗体50uL（先在ST单克隆抗体管中加0.5mL稀释液，混勺匀后全部吸出于1.6mL稀释液中，混匀备用），37℃水浴1h。96）洗板：用洗涤液Ⅱ洗3次，操作同上。（7）加酶标记兔抗鼠Ig复合物：称在酶标记兔抗鼠Ig复合物管中加0.5mL稀释液，混匀后全部吸出于3.6mL稀释液中混匀，每孔加100uL，37℃水浴1h。（8）洗板：用洗涤液Ⅱ洗3次，操作同上。（9）酶底物反应：每孔（包括第一孔）各加基质液100uL，室温下避光5～10min，再加入终止液50uL。（10）结果判定：以酶标仪在波长492nm下测定吸光度（0D）值：阴性对照OD值-待测样本OD值
×100%≥50%为阳性
阴性对照OD值
自测无色或明显淡于阴性对照为阳性。6.5.2双向琼脂扩散试验检测LT：将被检菌株按五点环形接种于Elek氏培养基上。以同样操作，共做两份，于36℃培养48h。在每株菌的菌苔上放多粘菌素B纸片，于36℃经5～6h，使肠毒素渗入琼脂中，在五点环形菌苔各5mm处的中央，按一个直径4mm的圆孔，并用一滴琼脂垫底。在平板的中央孔内滴加LT抗毒素30uL，用已知产LT和不产毒菌株作对照，于36℃经15～20h观察结果。在菌斑和抗毒素孔之间出现白色沉淀带者为阳性，无沉淀带有者为阴性。6.53乳鼠罐胃试验检测ST
将被检菌株接种于Honda氏产毒肉汤内，于36℃培养24h，以3000r/min离心30min，取上清液经薄膜滤器过滤，加热60℃30min，每1mL滤液内加入2%伊文思蓝溶液0.02mL。将此滤液用塑料小管注入1～4目龄的乳鼠胃内0.1mL，同时接种3～4只，禁食3～4h后用三氯甲烷麻醉，取出全部肠管，称量肠管（包括积液）重量及剩余体得。肠管重量与剩余体重之比大于0.09为阳性，0.07～中华人民共和国卫生部1994—03—18批准1994—09—01实施
GB4789.6—1994
0.09为可疑。
6。6结果报告
综合以上生化试验、血清学试验、肠毒素试验作出报告。附加说明：
本标准由卫生部卫生监督司提出。本标准由江西省卫生防疫站负责起草。本标准主要起草人何晓青。
本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。中华人民共和国卫生部1994—03—18批准1994—09—01实施
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