【国家标准(GB)】 食品卫生微生物学检验 沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的肠杆菌科噬菌体检验方法

GB4789.31—1994
中华人民共和国国家标准
食品卫生微生物学检验
沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的肠杆菌科噬菌体检验方法
Microbiological examination of food hygieneExamination of Salmonellae,Shigellae,and diarrhoeaCausative Escherichia coli by means of the diagnosticTyping phage set for enterobacteriaceaeGB4789.31—1994
1主题内容与适用范围
本标准规定了应用肠杆菌科噬菌体诊断法检验食品中沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的基本要求、操作程序和结果判定。本标准适用于各种食品、食物中毒的检验，也适用于食品从业人员的肠道沙门菌和志贺氏菌带菌检验。
2引用标准
GB4789.4食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验GB4789.5食品卫生微生物学检验志贺氏菌检验GB4789.6食品卫生微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验GB4789.28食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂3设备和材料
3.1温箱：36±1℃。
3.2水平仪。
3.3灭菌平血：90mm×15mm。
4号针头，头灭菌。
3.4定量滴管：每滴约10uL。用输液用的玻璃接管配4-2
3.5橡皮乳头。
灭菌棉签。
酒精灯。
3.8接种棒，镍铬丝。
3.9试管架。
4培养基和试剂
4。1营养琼脂、营养肉汤按GB4789.28中3.7和3.8进行。4.2蛋白陈水、靛基质试剂按GB4789.28中2.13进行。4.3三糖铁琼脂按GB4789.28中3.24和3.25进行。4.4肠杆菌科诊断用噬菌体，7种和3种。安启开后用无菌毛细吸管吸出移入灭菌小试管内，用无菌胶塞塞紧，放于4℃冰箱备用。5检验程序
肠杆菌科诊断用噬菌体检验沙门氏菌的程序见图1：中华人民共和国卫生部1994—03—18批准1994—09—01实施
GB4789.31—1994
图1肠杆菌科诊断噬菌体检验沙门氏菌的程序5.2肠杆菌科诊断用噬菌体检验志贺氏菌的程序见图2:图2肠相干菌科诊断用噬菌体检验志贺氏菌的程序5。3肠杆菌科诊断用噬菌体检验致泻大肠埃希氏菌的程序见图3：图3肠杆菌科诊断用噬菌体检验致泻大肠埃希氏菌的程序6检验步骤
6.1前增菌、增菌和分离
6.1.1沙门氏菌的前增菌、增菌的分离，按GB4789.4进行。6。1.2志贺氏菌的增菌和分离，按GB4789.5进行。6。1.3致泻大肠埃希氏菌的增菌和分离，按GB4789.6进行。6.2噬菌体试验
6.2.1培养基的准备
营养琼脂平板（含琼脂1%1.5%，琼脂量视其凝固性而定，约为一般用量的3/4），每个9cm平血中约25mL，放在水平台面上侯其凝固，翻转平板，在36℃半开血倒置约1h，以烘干培养基表面水分，并使琼脂具有显著的吸水性。6.2.2试验菌液的准备
从选择性鉴别平板上挑取菌落，一般应多挑几个菌落，以防遗漏。检验沙门氏菌时，不但应挑取乳糖阴性产HS和不产HS的菌落，还应挑取乳糖阳性产HS的菌落。检验大肠埃希氏菌时应挑取乳糖阳性或阴性的菌落3～5个。检验志贺氏菌时应挑取可疑菌落接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体管，于36℃培养过夜，次日选取三糖铁底层产酸、斜面产碱，不产HS，不产气无动力的培养物。下述两种方法可供选用。
6.2.2.1一法：将待试菌落接种于营养肉汤管内，于36℃培养过夜。挑取此肉汤培养物一满环，稀释于一管盛有1～2mL的蛋白陈水试管内，使成1：200～1：400稀释菌液，含菌量约为1×10mL。6.2.2.2二法：用接种针在鉴别平板上轻轻蘸取可疑菌落，挑取菌量不宜过多，稀释于一管盛有1～2mL蛋白陈水试管内，使其含菌量约与一法相似。6.2.3涂抹试验菌液
6.2.3.1斑点涂抹法：将营养琼脂平板表面自圆心超分为三等份，每等份可供涂抹一株细菌培养物。每挑取试验菌液一满环，涂抹直径约1cm的菌斑一个。每株培养物涂抹7个菌斑，外圈4个，内圈3个。6.2.3.2棉签涂抹法：用无菌棉签蘸取试验菌液并略挤去过多液体，在如上琼脂平板表面三分之一的区域内涂抹。三个涂抹区之间保持适当距离。略等数分钟，侯菌液干燥。
6.2.4滴加噬菌体
中华人民共和国卫生部1994—03—18批准1994—09—01实施
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用定量乳头商管在一个菌斑上滴加噬菌体一滴，依次为0-I、C、Sh、E、CE、E-4和Ent。滴管上安装4号针头，每毫升约为100滴。每支滴管只滴加一种噬菌体，针类绝对不能接触平板表面，严格防止交叉污染。每用一支滴管，可把全部待试菌应滴加噬菌体的菌斑部位全部滴加完毕。滴加噬菌体时必须将琼脂平板放在水平台面上。待7种噬菌体均滴加完毕后，略等灵敏分钟，待噬菌体液干燥。翻转平板，放36℃培养5～6h，并过夜各观察一次结果。如果仅有一两株培养物作噬菌体试验，则可用直径为3mm的接种环挑取噬菌体，依次滴加在菌斑上。灼热的接种环必须完全冷却以后方可挑取噬菌何等。6.2.5试验结果的判定
按表1判定噬菌体试验的结果。必要时吸取少许剩余的蛋白陈水培养物作靛基质试验，大肠埃希氏菌培养物一般为靛基质阳性。表1
肠杆菌科噬菌体诊断表
噬菌体裂解模式
判定结果
沙门氏菌属
沙门氏菌属（靛基质一）
大肠埃希氏菌（靛基质
弗劳地氏柠檬酸杆菌
志贺氏菌属*、大肠埃希
大肠埃希氏菌
大肠埃希氏菌
弗劳地氏柠檬酸杆菌、
大肠埃希氏菌
大肠埃希氏菌
阴沟肠杆菌
噬菌体阴性菌株（用生
化试验鉴定）
注：CL融合性裂解：-不裂解：·裂解或不裂解；（-）很少菌株裂解：*结合菌型预测，见表3。wwW.bzxz.Net
6．2.6供快速检验沙门氏菌的噬菌体简化诊断法采用如下3种噬菌体：
a.沙门氏菌C-I;
b.E多价噬菌体，包括E和Sh：
c.C多价噬菌体，包括C、CE和Ent。培养基和试验菌液的准备均同前法。涂抹试验菌液：斑点涂抹法将琼脂平板表面分为四等份，每等份可供涂抹一株细菌培养物。每株培养物涂抹3个菌斑，外圈2个，内圈1个。棉签涂抹法呆将试验菌液在琼脂平板上涂抹成带状，每个平板约可涂抹5条菌。略等数分钟，侯菌斑干燥。
依次滴加上述3种噬菌体，在36℃培养5～6h，并过夜各观察一次结果。按表2判定简化诊断法的结果。
表2三滴法噬菌体试验简化诊断表中华人民共和国卫生部1994—03—18批准1994—09—01实施
GB4789.31—1994
E多价
C多价
判定结果
沙门氏菌属
大肠埃希氏菌
弗劳地氏柠檬酸杆菌”
噬菌体阴性培养物
注：CL融合性裂解；-不裂解；·裂解或不裂解；*包括阴沟肠杆菌和少数大肠埃希氏菌。
6。3噬菌体不裂解培养物的补充生化试验有少数的沙门氏菌培养物不被0-I噬菌体裂解，并有少数的大肠埃希氏菌培养物不被相应噬菌体裂解。故应将不被各种噬菌体裂解的培养物接利三糖铁琼脂。以下分别按GB4789.4和GB4789.6进行。6。4血清学分型鉴定。
6.4.1沙门氏菌，按GB4789.4进行。6.4。2致泻大肠埃希氏菌，按GB4789.6进行。6.4．3志贺氏菌
6.4.31记录噬菌体试验的结果，并按表3判定血清学分型鉴定的方向。Sh噬菌体不裂解的培养物不属于志贺氏菌。已知全部志贺氏菌培养物均能被Sh噬菌体裂解，且将其稀释至1RTD时，有99%的志贺氏菌培养物仍应被裂解。表3
噬菌体试验的结果和志贺氏菌血清学分型鉴定的方向噬菌体裂解模式
注：CL融合性裂解；-不裂解；（）内为罕见的结果。志贺氏菌血清学分
型鉴定的方向
福氏1～5，（鲍氏
福氏1，4，痢疾2，
鲍氏5，7，11，16，
17，（宋内氏I）
宋内氏I，痢疾2，
福氏4，鲍氏5，16，
宋内氏Ⅱ，福氏3
福氏6，鲍氏1～4，
偶数型618（除16
外），痢疾3～12
鲍氏9，15
痫疾1，（宋内氏I）
鲍氏13
挑取三糖铁琼脂上的培养物，按噬菌体裂解模式，选用相应的志贺氏菌分型因子血清，做玻片凝集试验。如果由于K抗原的存在而不出现凝集，应将菌液煮沸后再检查。
6.4.3.2如按噬菌体裂解模式提示为福氏志贺氏菌1～5型，可先用福氏多价血清做凝集试验。如果呈现凝集，再分别用各型和群因子血清检查，以确定所属血清型和亚型（见GB4789.5表2）。6.4.3.3如按噬菌体裂解模式提示为福氏6型，鲍氏各型或痢疾3～12型，可先用福氏6型血清做凝集试验。福氏6型血清不凝集者，可用鲍氏多价血清或中华人民共和国卫生部1994—03—18批准1994—09—01实施
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或痢疾3～12多价血清做凝集试验。如果吴现凝集，再分别用各型因子血清检查。6.4.3.4如按噬菌体裂解模式提示为宋内氏Ⅱ相菌而不被宽阔内氏血清凝集时，可直接按噬菌体裂解模式和粗糙形菌落特征判定之。6.4.3.5按噬菌体裂解模式所提示的方向做血清学试验不凝集者，或虽发现其被某一个分型因子血清凝集而与噬菌体裂解模式不相符乾，或虽与噬菌体裂解模式相符但不被1RTD的Sh噬菌体裂解者，均应做葡萄糖铵试验以与大肠埃希氏菌相鉴别。葡萄糖按试验阳性乾为大肠埃希氏菌。必要时带可以做如下的生化试验，即：乙酸钠、克氏柠檬酸盐和粘液酸的利用试验，赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶、七叶的分解试验。除宋内氏和鲍氏13型为鸟氨酸阳性、宽阔内氏菌的少数菌株可利用粘液酸，福氏4a型的少数菌株可利用乙酸钠外，志贺氏菌属的培养物均为阴性结果。这些试验中任何阳性结果均提示为大肠埃希氏菌。6.4.3.6检出的志贺氏菌培养物应符合该群的生化特性（见GB4789.5表3），但福氏6型与A群或C群相似。靛基质阳性的志贺氏菌血清型为痫疾2型、7型和8型，鲍氏5、7、9、11、13、15、16和17型，但福氏1～5型的靛基质反应较弱；靛基质阴性的志贺氏菌血清型为痢疾1型、3～6型、9~12型、福氏6型、鲍氏1～4，6，8，10，12，14和18型，和宋内氏菌。6.5大肠埃希菌肠毒素试验
按GB4789.6进行。
6.6结果报告
6.6．1沙门氏菌检验的结果报告6.6.1.10-I噬菌体裂解，其他均不裂解者，经沙门氏菌血清分型后报告；或符合上述裂解结果，但尚未做血光天化日分型试验者，可报告为沙门氏菌未分型。
6.6.1.2各种噬菌体均不裂解，但生化试验确定为沙门氏菌，经沙门氏菌血清分型后报告；或符合上述生化试验结果，但尚未做血清分型试验者，可报告为沙门氏菌未分型。
6.6.13非如上述的裂解结果，或生化试验否定为沙门氏菌者，可报告为非沙门氏菌。
6.6.2志贺氏菌检验的结果报告
6.6.2.1Sh噬菌体裂解，呈现各种裂解模式，血清学试验与裂解模式相符者，可报告志贺氏菌分型结果。罕见血清型要求被1RTDSh噬菌体裂解，并符合志贺氏菌生化分群结果。
6.6.2.2非如上述的试验结果均报告为非志贺氏菌。6。6.3致泻大肠埃希氏菌检验的结果报告6.6.3.1E和或Sh、E-4噬菌体裂解，不同来源菌株的裂解模式具有同一性，经血清学分型确定者可分别报告为产肠毒素大肠埃希氏菌（要求有肠毒素试验结果），侵袭性大肠埃希氏菌（要求赖氨酸阴性、动力阴性，但0124亦可为动力阳性），肠道出血性大肠埃希氏菌（限于0157）或肠道致病性大肠埃希氏菌。6.6.3.2各种噬菌体均不裂解，经生化试验符合大肠埃希氏菌，并经血清学分型确定者，亦可分别报告各类致泻大肠埃希氏菌，其要求与6.6.3.1相同。6.6.3.3非如6.6.3.1和6.6.3.2结果均报告为非大肠埃希氏菌或非致泻大肠埃希氏菌。
中华人民共和国卫生部1994—03—18批准1994—09—01实施
GB4789.31—1994
附加说明：
本标准由卫生部卫生监督司提出。本标准由江西省卫生防疫站负责起草。本标准主要起草人何晓青。
本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。中华人民共和国卫生部1994—03—18批准1994—09-—01实施
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