【国家标准(GB)】 奥尼罗非鱼亲本保存技术规范

ICS 65. 150
中华人民共和国国家标准
GB/T19528—2004
奥尼罗非鱼亲本保存技术规范
Technique standard in holding the parents of hybrid betweennile tilapia早 and blue tilapia含2004-05-31发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2004-10-01实施
本标准的附录 A、附录B和附录 C为规范性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国水产标准化技术委员会淡水养殖分技术委员会归口。本标准起草单位：中国水产科学研究院淡水渔业研究中心。本标准主要起草人：吴婷婷、杨弘、李建林。GB/T19528—2004
1范围
奥尼罗非鱼亲本保存技术规范
GB/T19528—2004
本标准规定了奥尼罗非鱼亲本-奥利亚罗非鱼（Oreochromisaurea）和尼罗罗非鱼（Oreochromisniloticus)的来源、纯种鉴别、隔离饲养、提纯复壮和建档管理技术。本标适用于奥尼罗非鱼亲本的保存。2 规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。NY/T5054无公害食品尼罗罗非鱼养殖技术规范SC 1027尼罗罗非鱼
SC1042奥利亚罗非鱼
SC/T1045奥利亚罗非鱼亲鱼
SC/T1046奥尼罗非鱼制种技术要求3亲本来源
奥利亚罗非鱼来源按SC/T1045的规定执行。3.11
3.2尼罗罗非鱼来源按NY/T5054的规定执行。4亲本纯种鉴别
4.1形态学鉴别
奥利亚罗非鱼的外部形态特征应符合SC1042的规定，尼罗罗非鱼的外部形态特征应符合SC1027的规定。
4.2细胞遗传学鉴别
奥利亚罗非鱼的染色体数与核型应符合SC1042的规定；尼罗罗非鱼的染色体数与核型应符合SC 1027的规定。
4.3生化传学鉴别
在血清酯酶的等电聚焦电泳图谱上，奥利亚罗非鱼具有一条等电点为pH4.69的特异性酶带，尼罗罗非鱼具有一条等电点为pH4.63的特异性酶带。血清酯酶等电聚焦技术见附录A。4.4分子遗传学鉴别
4.4.1酶切线粒体DNA标记技术
用限制性内切酶Pvu Ⅱ酶切在尼罗罗非鱼 mtDNA上有 3个或 4个 Pvu IⅡI位点，奥利亚罗非鱼mtDNA上有5个PvuⅡ位点。酶切线粒体DNA标记技术见附录B。4.4.2随机扩增多态性 DNA 技术(简称RAPD技术）应用RAPD技术筛选出四种引物可检测奥利亚罗非鱼或尼罗罗非鱼。引物OPZ06,奥利亚罗非鱼有一条900bp的片段，在尼罗罗非鱼中没有。引物OPZ10,尼罗罗非鱼有条1500bp的片段，在奥利亚罗非鱼中没有。引物OPZ12,尼罗罗非鱼有一条1700bp的片段，在奥利亚罗非鱼中没有。1
GB/T19528—2004
引物OPZ19，尼罗罗非鱼有一条730bp的片段，在奥利亚罗非鱼中没有。RAPD标记技术见附录C。
5隔离饲养
5.1养殖
奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼的苗种、成鱼与越冬期的养殖均按NY/T5054的规定执行。5.2隔离措施
5.2.1制定隔离保种制度，并严格执行，定期检查。5.2.2纯种繁殖用鱼池和供生产奥尼杂交鱼用鱼池要严格隔离。5.2.3奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼分区专池饲养，各区建立独立的进、排水系统，进、排水口安置过滤网，严防混杂。
5.2.4不同来源、不同家系、不同世代的奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼要分池隔离饲养、越冬。6提纯复壮
6.1选育方法
6.1.1第一次筛选是在苗种培育结束时进行生长优势的个体选择，选留群体数量≤总数的2/3。6.1.2第二次筛选是鱼种培育到100g/尾左右的鱼种时，选留符合SC1042和SC1027的规定，表型优良、生长快的个体。
6.1.3第三次筛选是在后备亲鱼人池越冬时，选留符合SC1042和SC1027的规定及生长快的个体。6.1.4第四次筛选是在翌年春出越冬池时，严格按照SC1042、SC1027和SC/T1046的规定进行，并放人产卵池繁殖。
6.2品种提纯
采用混合选择和家系选择相结合的方法。混合选择是从原品种繁殖的后代中，选出符合SC1042、SC1027和SC/T1046的规定、表型优良的个体，建立5～6个家系，分池饲养，培育成亲鱼。对所建的每个家系留1000尾（雌800尾，雄200尾）以上的优良个体，进行同代同血缘的同质选配，对后代进行精心培育，然后在苗种、100g/尾鱼种时、人池越冬前、春季出池时四个阶段按选育目标进行去劣留优。如此经四个世代筛选，最后选出2～3个优良的家系。6.3复壮
6.3.1选择性状良好，生长快，繁殖力强的不同家系，进行配对繁殖。子代按5.2.3隔离饲养。6.3.2保留1000尾（雌800尾，雄200尾）以上的不同品种、不同家系、不同世代的亲本，以便保持各自后代群体的杂合性，降低近交系数，防止品种退化。6.3.3进行严格而持续的选择。
7建档管理
7.1建档
建档的原始资料一般为：引种来源、原名、原来性状、检疫、引进单位、时间、地点、数量、规格、成活率。“
7.2育种记录bzxZ.net
育种的主要记录如下：
一引进种的培育：鱼池面积、水源、水深、水质、放养量、投饵施肥、生长、病害防治及日常管理等。繁殖：配伍、催产、孵化、出苗情况等。一一苗种培育：品种、面积、水源、水深、水质、放养量、饲养管理、病害防治、选育、出池、销售等情况。后备亲鱼培育：品种、面积、水源、水深、水质、放养量、饲养管理、病害防治、选育、出池、销售等2
情况。
7.3选育记录
选育的主要记录为：
GB/T19528—2004
a）第一次筛选：鱼苗至鱼种时，选留数量、平均体重（群体平均体重量）、表型性状。第二次筛选：鱼种至100g体重时，选留数量、平均体重（群体平均体重量）、表型性状。b)）
c）第三次筛选：100g体重至越冬时，选留数量、平均体重（群体平均体重量）、表型性状。d）第四次筛选：越冬至翌年春出池时，选留数量、平均体重（群体平均体重量）、表型性状。生产中及时、准确记录、定期汇总归档，并接受监督检查。7.4
提纯复壮记录
提纯复壮的主要记录为：品种、来源、家系、世代、性状、育种（按7.2记录）、选育（按7.3记录）3
GB/T 19528—2004
A.1血样制备
附录A
（规范性附录）
血清酯酶等电聚焦技术
从鱼的尾静脉抽取血液0.5mL，室温下放置2h，析出血清，然后以3000r/min，离心15min，放人一20℃冰箱保存。
A.2等电聚焦电泳
样品用重蒸水稀释 5倍，取15 μL点样。等电聚焦电泳在5%聚丙烯酰胺凝胶上进行，条件为pH4～6两性载体电解质，电压1500V，电流25mA，功率20W，电泳2h。A.3染色
室温条件下，电泳凝胶在染色液中染色至出现蓝色酶带。A.4溶液配制
A.4.1染色液
固蓝RR盐
o.5mol/LTris-HCl,pH7.1
1%α-,β-乙酸萘酚
蒸馏水
A.4.21%a-,β乙酸酚
α-乙酸萘酚
β-乙酸萘酚
蒸馏水
B.1线粒体 DNA的提取
附录B
(规范性附录）
酶切线粒体DNA标记技术
GB/T19528—2004
取新鲜罗非鱼肝脏约15g，加5倍体积缓冲液I，用玻璃匀浆器匀浆，匀浆液在3000r/min离心15min，去除细胞核及碎片。重复上述步骤一次。上清液用12000r/min离心20min，收集沉淀。再重复上述步骤两次，即得到线粒体。将沉淀充分悬浮于缓冲液Ⅱ中，加两倍体积溶液1裂解线粒体，冰浴10min后加1.5倍体积溶液Ⅱ终止反应。10000r/min离心30min，取上清液用等体积饱和酚抽提两次，再用苯酚-三氯甲烷-异戊醇（25：24：1)抽提一次，离心后取水相，加两倍体积预冷无水乙醇，在一20℃下过夜。次日在15000r/min离心30min，收集线粒体DNA，干燥后溶于适量的缓冲液Ⅲ中，加不含DNA酶的RNA酶,37℃水浴1h以分解RNA。再用酚、酚-三氯甲烷-异戊醇抽提蛋白质后，沉淀、干燥，将所得线粒体DNA溶于灭菌水中，4℃保存备用。B.2线粒体DNA的酶解反应
按内切酶生产厂家提供的方法进行线粒体DNA酶解反应。加缓冲液IV终止反应。B.3琼脂糖凝胶电泳
凝胶浓度为1.2%~1.5%，胶中含0.5μg/mL溴化乙锭，电泳缓冲液为TAE，在室温下电泳，电压为1V/cm，电泳16h。电泳毕在紫外灯下观察拍照。B.4酶解片段大小的计算
以入DNA/EcoRI+HindⅢ和入DNA/Hind Ⅲ完全酶解片段作为分子量标准。根据Southern[1979]的公式计算酶解片段大小：从凝胶上选取三个相邻的分子量标记，其分子量从大到小（或从小到大)依次为L1、L?、L3，以碱基对 bp或干碱基对 kb计算，其迁移距离分别为 m1、m2、m3，如一个分子量为 L,迁移距离为 m 的待测图带位于ml和ms之间,则：
其中：
式中：
ms - mi[(L L,)/(L, - L3) ×(mg - m2)/(m2 m)]mo
1 -[(L, - L,)/(L, - L3) × (m -m2)/(mz - m)]L, — L2
Ki = 17(m - mo)-17(m - mo)
K2 = Li
mi 一mo
L—分子量，单位为碱基对(bp)或干碱基对(kb)；m—迁移距离，单位为厘米(cm)。B.5主要试剂配制
....( B. 2 )
.( B. 4)
缓冲液I：SET-蔗糖缓冲液(100 mmol/L氯化钠，10 mmol/LTris-HCl,0.1mmol/LEDTA，5
GB/T19528-2004
250mmol/L蔗糖，pH7.8)。
缓冲液Ⅱ：TE-葡萄糖缓冲液（50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCl,10mmol/LEDTA，pH 8. 0)。
缓冲液IⅢI :TE缓冲液(10 m mol/L Tris-HCl,0.1 m mol/L EDTA,pH7.5)。缓冲液IV：酶解反应终止兼载样缓冲液(10 m mol/LTris-HCl0.1 m mol/L EDTA，pH7.5）)。溶液I：碱性SDS溶液(1%SDS,0.2mol/L NaOH)。溶液IⅡ：3mol/L乙酸钾溶液（pH4.8,对K+为3mol/L，乙酸根离子为5mol/L)。TAE电泳缓冲液：0.04mol/LTris-乙酸，0.002mol/LEDTA。C.1罗非鱼DNA的制备
（规范性附录）
RAPD标记技术
GB/T 19528—2004
用浸有 ACD抗凝剂的针简从鱼尾静脉抽血 0.5mL～1 mL,将血样放在4℃中静置 30 min,使血细胞下沉。吸取血细胞30 μL,加人 470μL SET缓冲液中，再加入10 mg/mL的蛋白酶K，混匀后加人12.5μL20%SDS溶液，轻轻混匀后置于55℃水浴消化过夜。次日将消化液用等体积的饱和酚、酚-三氟甲烷-异戊醇的(25：21：1)和三氯甲烷-异戊醇（24：1)各抽提次。弃去下层有机相，向水相中加人两倍体积-20℃预冷的无水乙醇沉淀DNA。将DNA沉淀清洗、干燥，溶于适量的TE(pH7.4)缓冲液中。用紫外分光光度计测量DNA样品的浓度和纯度，再稀释至10ng/μL，置于4℃保存备用。C.2RAPD扩增反应
扩增体系共25μL，含有50mmol/L氯化钾，10mmol/LTris-HCl,2.0mmol/L氯化镁，0.1%Trition X-100,dATP、dCTP、dGTP、dTTP各 0.2mmol/L,15 ng 随机引物,20 ng模板 DNA,1.5单位TaqDNA聚合酶，灭菌重蒸水。RAPD反应条件：94℃下预变性2min～5min，再进人循环，94℃变性1min，36℃退火1min，72℃延伸2min，经过35～45个循环后，再在72℃下延伸10min。C.3电泳检测
扩增产物取出后，加人十分之-一体积的10×BPB上样缓冲液混匀，在1.4%含0.5μg/mL溴化乙锭的琼脂糖凝胶中电泳。DNA扩增条带的分子量测定与附录 B相同。
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。