【国家标准(GB)】 饲料中大肠菌群的测定

ICS_65.120
中华人民共和国国家标准
GB/T18869--2002
饲料中大肠菌群的测定
Determination of coliform bacteria in feeds20032
标准馆藏
2002-09-24发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2003-03-01实施
本标准在查阀大量资科文献和样品检测的紫础上制定TAONTKAca
GB/T18869—2002
本标准的制定其技术内容主要依据GB1789.3—1994食品.1生微生物学检验大肠菌群测定”。
本标准的附录A.附录B均为规范性附录。本标准由全国饲料工业标准化技术委员公提出。本标准由全国间料工业标准化技术委员会归口。本标准由国家饲料质量监督检验中心(北京)负责起草。本标准主要起草人：李丽蓓、饶正华.杨曙明、高生。饲料中大肠菌群的测定
GB/T 18869—2002
警告一使用本标准的人员应有正规实验蜜工作的实践经验。具备适当设备的实验室才能承担检验。应小心处理所有废弃物。
1范围
本标准规定了饲料中大肠菌群的测定方法。本标准适用于配合饲料、浓缩饲料,饲料原料(骨粉、肉骨粉、鱼粉.乳清粉等)中大肠菌群的測定。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括期误的内寄）或修订版均不适用于本标准，辫而，鼓励根据本标谁达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本，凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB4789.28—1994食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂GB/114699.1间料采样方法
3原理
将试样稀释至适当浓度,用乳糖胆盐发酵培养基,在（36士1)下培养(24土2）h,根据确证试验为大肠菌群阳性的管数，查出每 100 g(mL)试样中大肠菌群的最大可能数(MPN)。4试剂和村料
除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和馏水或相当纯度水。以下试剂制备具体要求见附录A。a）乳糖胆盐发酵培养基:见第A.1章。b）伊红美蓝琼脂平板：见第A.2章.r）乳糖发酵培养基,见第A,3章。d）群酸盐冲稀释箍：见第A，4草。e）生理盐水。
f）革兰氏染色液:见第A.5章。
5仪器.设备
5.1培养箱：36℃±1℃。
5.2显微镜:普通生物显微镜。
5.3均质器或乳钵。
5.4平m：直径为90mm
5.5试管。
5.6吸管:1 mL
5. 7 广口三角瓶:容量为 500 mL。5.8玻璃珠，直径约5mm。
5.9载玻片。
GB/T18869—2002
5.10酒精灯。
5.11试管架。
6采样
按照GB/T14699.1的要求执行。采样器具要灭菌消毒。7分析步骤（见附录R）
7. 1检样稀释
TKAONTKACa-
7.1.1以无菌操作将试样25g（或mL)放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的次菌玻璃瓶内（瓶内预胃适马数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1：10的均句稀释液。固体试样最好用均质器，以8 000 r/min~-10 009 1/min 的速度处埋1 rrir1.做成1：10的笃匀烯释腋。7.1.2用1 mL.灭菌吸管吸取 1：10稀释液1 mL,江人含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混匀，做成！：100的释液。7.1.3另取1ml.灭菌吸管，按上条操作依次做10倍递增稀释，每递增娣释一次：换用一支1ml.灭菌吸管。
7.1.4根据对试样污染情况的估计，选择三个稀释度.衔个稀释度接种3管。7.2乳糖发酵试验
将得检试样接种于乳糖胆盐发酵管内,按种量在 1 L 以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,1 mI.及1mL以下者用单料乳糖胆盐发悸管。每一稀释度接种3答，置36C士1C:培养箱内，培养24h一2h·如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产：气者.则按下列程序进行。7.3分离培养
将产气的发酵管分别转接种在饼红关监琼脂平板上.置36C上1C培养箱内,培养18h-~24 H-然后取出观察菌落形态，并做确证试验，7.4确证试验
在上述平板上·挑取川疑大肠菌样菌落1个-2个进行苹兰氏染色,同时接种乳糖发醛管,置36C士1℃培养箱内培养24h=2h，规察产气情况，凡乳糖管产气、苹兰氏染色为所性的无芽跑杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。
7.5报告
根据确证为大肠菌群附性的管数,查MPN检索表(表 1),报告每 100 g(mI.)试样中大肠菌群的最大可能数，以\个/100 g(ml.)\表尔：表1大肠菌群最大可能数(MPV)检索表阳性管数\
1 mL(g)X3
0. 1 ml.(g)>:3
001 ml×3
【100mL（g）试#）
95%可信限
GB/T 18869—2002
表1（续）
955%可信限
阳性营数”
[100 mL(g)试样］
0. 01 mL(g)X3
0. 1 mL(g)×3
1 mLg)×3
GB/T 18869—2002
1 mL(g)X3
阳性普数”
0. 1 mL(g)X8
表1（续）
0. 01 mL(g)X 3bZxz.net
(100 mL(g)试样了
224000
本表采用二个稀释度[1 mL(g), 0. 1 mL(g)和 0. 01 ml(g)],每稀辩度 3 管。上限
-TTKAONTKAC-
95%可信限
b 表内所列试样量如收用 10 mL(g),1 mL.(g)和 0.1 mI(g>时,表内 MPN数字应相应降低 10倍;如改用 0. 1mL(g）)、0.D1mL(g）和0.a01mL(g）时.则表内MPN数学应相应增加10倍。其余可类推。附崇A
（规范性附录）
试剂和培养基制备
以下培养基的制备按G34789.28--1994的规定A，1乳糖胆盐发酵培养基
A.1.1成分
蛋白陈
猪胆盐(或牛，羊胆盐）
0.04%溴甲酚紫水溶液
蒸馏水
A. 1.2 制法
1 000 mL
GB/T 18869-2002
将蛋白陈、胆盐及乳糖溶于水中,校止pH,加人指示剂,分装每管 10 mL,并放人一个小导管,115C高压灭菌 15 min。
往：双料乳糖胆盐发酵管除蒸馏水外，其他成分加借。A-2伊红美蓝琼脂(EMB)）
4.2.1成分
蛋白陈
磷酸氢二钾
2%伊红Y落液
0. 65%美蓝溶液
蒸馏水
A.2.2制法
1 H00 mL
将蛋口陈,磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中,校正 pH,分装于烧瓶内,121℃高压灭菌 15 min备用。临用时加人乳糖并加热溶化琼脂：至50~55℃，如入伊红和美蓝溶液，摇勾，倾注平板。A.3乳糖发酵培养基
A.3.1成分
蛋白陈
0. 04 %溴甲酚紫水溶液
蒸馏水
A.3.2制法
1 000 mL
将蛋白陈及乳糖溶于水中,校正 pH,加人指示剂,按检验要求分装 30 mL,10 ml. 或 3 ml.,并放人5
GB/T18869—2002
一个小导管，115℃高压灭菌15min。注：双料乳糖发醇管除蒸馏水外，其他成分加倍。3抢工乳着发醇管供大肠商群证实试验用。A.4磷酸盐螺冲液
A.4.1储存
磷酸一,氨钾
c(NaCOH)=Imal/L氢氧化钠溶液
燕馏水
A.4.2制法
825 mL
TTKAONTKACa-
先将磷酸盐溶解于500 L馏水中，用1mol/L氢氧化钠溶液校正pH后，再用蒸馏水稀释至1000mL.
A.4.3稀释液：取储存液1.25ml.，用蒸水稀释至1000mL。分装每瓶100mL或每管10ml.,121℃商压灭菌15min。
A-5革兰氏染色法
A.5.1结晶紫染色液
结晶紫
05%艺醇
10/L草酸镂水溶液
将结品紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。A.5.2革兰氏碘液
碘化钾
蒸馏水
将碘与碘化先进行混合：加人蒸馏水少许，充分振探,得完全溶解后，再加蒸馏水至30心ml.A.5.3沙黄复染液
95%艺醇
蒸馏水
将沙黄溶解扩乙醇中,然后用蒸馏水稀释。A.5.4染色法
10 rnl
A.5.4.1将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液.染1min，水洗.A.5.4.2滴加革兰氏碘液.作用lmin，水洗，A.5.4.3滴加95%乙醇脱，约305,或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去再用乙醇滴满整个涂片，脱色10s。
A.5.4.4水洗，滴加复染液，复染1min。水洗，待十，镜检。A.5.4.5结果
革兰氏阳性菌吴紫色。革兰氏阴性菌呈红色注：亦可用 1 1 10稀释右激酸复红染色液作复染液,复染时间仅 10 s。6
大肠菌群检验步骤地图 B.1.
不产气
大肠蘭群阴性
草兰氏染色
革兰氏阳性
大肠菌群阴性
附录B
（规范性附录）
大肠菌群检验程序
乳秘肥盐发酵管
(36±1)℃, (24±2)b
伊红美蓝琼脂平板
(36±1)C,18h~24h
乳糖发酵管
(36±1)℃,(24+2)h
革兰氏期性无芽孢杆菌
大豚菌群阳性
大肠菌群测定步骤图
不产气
GB/T 18869--2002
大肠菌群阴性
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