【国家标准(GB)】 养殖鱼类种质检验 第12部分：染色体组型分析

ICs 65. 150
中华人民共和国国家标雅
GB/T 18654. 12 2002
养殖鱼类种质检验
第12部分：染色体组型分析
Inspection of germplasm for cultured fishes-Pari 12:Meihod For the karyutype analysis2002-02-19发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2002~05-01实施
CB/：%654殖鱼类种质检验3分为下列部分：一第二部分：校验现则，
-：等2部分州作方决：
第3部分：性状测定：
一一第4部分，血龄与生长内测定多5部分：含性次析！
第6部分蒙殖性能的测定
一势7部分：生念物件分析：
一·第8部分柜率与临界室息点的理定一受9部分：个肉年测定：
第0部分：肌肉代养分的测定
资1部分，以肉中土恶氨基酸含最范测定！第_2部分：染色体组题分析
募：3部分：同丁海电谈分析
第4部分NA含量的测定：
第15部分：RAP1分析
2部价为GBT18654的第12带分，
在部分范系A，附录B为资科性附民：主部分中中华人民共和国程业部提本部分由中国水产科学北院长江水产研究所归口。部分起草单位，中用水产科学研究统长汇水产研究所，工海水产大学。本部分主要起岸人：曾勇、欲出法、享尽发，周瑞英何力：GB/T18654.12—2002
养殖鱼类种质检验
第12部分：染色体组型分析
GB/T18654.17—2002
GB/T1851的本部分规定？鱼类染色体组型分析的试剂和材料.收.器和设备，玻片标本的制备和组型分析。
本部分适用于鱼类染色体组型分析，对平水产养始中的其他小牛动物亦可荐照效行。2规范性引用文件
下列文中的系通过G/84的本部分的引用而感为本部分的条款，凡昆许日期的引用文件，其随后所有的改单（不包括期误的内容)或您订版均不适月十本部分，然而，兼励根据本部分达成协议的卒方妍究是否叫使用这业文件的量新献本。凡是不性日期的引用文件，其最新版木用于木郝分.
GB/门_6654.2殖鱼美行质按骏第？部分：拍样力3术语和定义
下术语定义适用于B185的本部分。3.1
体细胞体外培养法snmaticrellcultureinltro通斗无菌操作、获求鱼的肾影组或血红施，在体外培养过强中，加人细咆分裂刺激物，刺避淋巴细大过人分裂状态.后，加人站当浓座的献水仙象使细题分双散阻抑在分裂中期.而获得鱼类细题体中期分裂抖。
体细胞体内培养法somaticcellcultureinvivp通过向鱼沐内注射细单分裂刺激物，此激浙巴洲大站进人分激状态。然后，取出写脏组织在生项盐水！将头件，再加人适当浓度前秋水仙素，或直接间鱼休内注射适当剂量的秋水仙衰，从而使细胆分裂阻抑在分裂中期，获得鱼类细胞资包什中期分裂相：3. 3
体细胞直接法dlrectuseofsomaticcclls将小鱼泛泡在证当浓性的伙水索落教中，续其分裂虚的施丝上皮细他敏阻抑在分裂中期，而费得血类细随染色中期分然却。
胚胎细胞直法directlyseorembryocells选用变育让常的癌匠制成原期早期胎，将其细题吹打分做后·和人当浓度的秋水仙求-组冲在分融中期券得迫类细服梨色体中期分裂相。3.5
GB/T18654.122002
空气干燥法oir-dryingtechnique将收集的细胞丝过低落、固定，筛片，然后斜放静置，待其口然下燥，3.6
火焰干爆法flame-dryinlechaique将收集的细胞经斗低渗、固定、滴片、然后止即玻片置于润特灯的火始上均与灶烤、或自接将玻片置丁火增上滴片。
臂比arm ratlo
染色体的长曾长度与短肾度之比。3.8
相对长度relativelength
每条染色述长理与单惜体组染色体总长座之比，以百分省或分信表示.4方违规要
使用胎分裂刺激物剂激鱼类淋巴细胞分效，或者声按收集分裂旺范丝上皮细胞、肝胎细脂。然活判用秘水仙索被坏纺链丝阻抑在分裂中期：再经低滚、固定、减片和染白，最进行境哈分析5试剂和树料
5.1肝本培液：浓度为300TT:/mL..5.2、小牛或陷牛血清。
5. 3有季素、诺年旁和F那垂素：5.4培养基：7t-199.RPMI-164n成FaglesMEM培养装配制法：上注培养基阳加然光小牛成胎牛工消每毫升培获液含古幕索斑毒素、卡那每紊分别为OI利IL用碳酸氢构(NHCO>溶液凋至H.。5.5物血求凝央素(THL1)溶淡，根据厂家推举消罩伙用。5.6生理水；0.75%氯化钠(>mC1)微：注，51--元中试别均需整过曲，5.7秋水仙素降满：准度为20/ml12/m5.8市商。
5.9述乙酸.
5.10定液：3价中序加1份冰7校税用现配5.11低热游液：0.0375mo1/L氯化钾（K>深液5.12吉姆萨（Giemsa)原液：称.5gGiemsaHH33aL在体内用少过油与Giemsa池合研培率无颗粒对,骨将刺余廿油倒人，在56心条件下保指2小片,人3mL中醇保存十掠色短内，5.13磷醛冲链（P强)浓度为.2m1/].配制方运见表1表1同H值的PBS配方
plI信
A>2mol/.图酸钠(NO
1能c.2mol/L酸二钠(Nal[-]O)]
6收裕和设备
6. 1无的室，
6.2超序作台.
6.3恒源培养粘或二气化碳培养带。6.4离心机。
6.5天平滤最0.00001gWww.bzxZ.net
6.6显微银（带点微提影
6.7照相机.
6.8楚套暗室设备，
6.9游标卡尺（精度0. 01mm)
6.10消控电热板.
6. 11 解别,J,其一套。
6.12生村器及针泌。
6.13可调移较讲10J--200
6.14细口吸吸件，5ml.~1UmL离心管，冰冻改1熟裁披片，6. 1525 mL培养瓶现青,链每求小瓶,顺窖等.7玻乃标木的制备
7.1抽样
样品鱼的抽详接TT185.，2的见定执行。7.2体细胞体外培养法
GB/T18654.12：2002
休细胞沐外落养法常采用肾纠纠继跑培养和工细他培养。本部分汉规定了肾垫红细胞培养的操作步骤，血细培养的换作步骤参见时录A：了.2.1将式详鱼朗血管断，尽量放血：刮太位年一例的解片，心其是解制部位刮十净，7.2.2把位放在超净作价上变无菌室内，铺上消毒钞布：历填酒和酒端棉球依次消毒已去麟的部位。7.2.3账取3ml.~5ml，落养没于游案瓶中：7.2.4解剖小架存推下方（鱼频上面切开适当长度，用解能剪将胶有剪所萃出肾，7.2.5银了光取适量肾组织、放人需有培养胶的青摄索瓶中，等组纠块用疆子渐碎，轻轻携动：然行都骨证持来撕碎的组！快流淀.用刻度吸管吸取上部细爬量液，移人落差瓶内，再加人适量括培养液，生你板为4mL或mL。细咆的密斑可识日测独度逆行粗略两整，或用血球计数板计数后确定，股5~10个/ml
7.2.6用汁点器滴PITA，一般为L.择养液加0.1mL-0.2ml，盖上收案，轻轻播匀7.2.了将已接种的择养瓶半整在和滞养箱成二载化成跨养书：让正需松血案内。培养温度一般为18℃--28，时叫1d~5d其间+细题-般分滚--次，可根据只外请说月合运的培养温度知时间。每天步将普养册轻经超动1~2次
7.2.8收集细胞：在收实组临前1.551本数垒叫提前用u满格滴器入伙水仙整液·他其终涨度为0.1/L--0.5g/mt，培养乘.收其细跑时：光摇动培养起.行名应悉浮，燃后将其例人离心，再小量现益水将培养版内残留细脑洗出再阅逊商心管，7.2.9低滤，将收集有细必书离管以70nr/mir~1Gor/mn离心nmia。然后轻轻融除上清液.约留\.5ml.纸胞沉淀。川人1mL抵净游散，月驱管吹打均室温或37条件下静胃$min~50mil。入-现定吹匀以wm~m离心5
7.2.10州定：先吸除上报，加人少许固定浓，吹打均勺再加人2nl.3m质定减静置2aia按3
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7.2.沙规定岛心。再再复固定1必要时可年固定三次.7.2.71满片；吸除上消较，加逻最现配固定裘，转细胞吹打均。吸取细啦需泌在43\倾斜前冰冻玻片上滴23滴，轻轻吹动，使细验铺放升：然后特改细胞的玻片斜效静置，特其自然十燥，此为空气干燥陆，有时为使染色体分散更，可采州火悼十燥法，7.212染色：用群酸盐般冲没（H=7.2)物Gim原般按9：1研释配成工作滤（用时配），长一块下净的玻聘，以培小丁玻片长度为间距效置下净玻片作架，物待染的披片需于染色的穿器内，将染液训人，染色10min--20mn后家出用自来水冲去来减，下焕后即可用了观察分机.7.3体胞体内培养法
7.3.1往样品鱼股腔注射PHA落液，剂草安厂家推学剂量使用.然尼续编价养6h--21a7.3.2处死鱼前？h~上接14鱼体重膜整往射秋水仙素溶波。将朗丝血竺剪晰，尽早放血，取也肾脏组织，放人盛有3加L--51生理盘水的声母衰瓶中：将组织划斯疗，用摄了抢轻抛动后静置mir~mir待本的就织以沉淀用吸觉吸取细脑满，加人离心节中。成者不注射水仙需，面是先将肾组织取出：撕碎，放人些有培养激的手通系十，加入就术仙来帝减.终谁度为u.1g/mL-G.5uR/mL培养液，于心群置2h~3h，然后用摄子经轻撮满，特稍沉症后，用账骨吸出上层细脑基商，人离心管中：7.3.3低落，固定、片、集色分别按7.2.1~.7.2.12的规定执行，7.4体细酸直糖法
此法适用于难以取肾的小位。
了.4.1游试样鱼散人含有浓度为0.秋水仙京液的容解中没泡5h在右。7.4.2放血柔鱼，小心把鯉片单下，将课丝敏人低液小低漆2min~30mL，7.4.3低楼的丝放人甲醇：冰乙酸为9：1范定液中设泡处理Yn~1m再转入100%的冰乙酸中泡处理1mi--2min。
7.4.4卡诺氏固定减固定2~%改，每次1h.最后次可放在常温或冰箱中1h15h。7.4.5清片前，将固定过的规丝放人5%的冰乙酸中，用链于卖们激效轻轻娠动，位细脑从阅丝上脱落·丢介鳃些.减体则为细胞尽液。7.4.6将细胞感液激州控漏电热板上5C--50r.的十净肢.片上，5mir.吸弃多余液车.7.4.7染色按\.2.12的现定执行。7.5压胎细胞直接法
7.5.1出人：啦营挑选发育正常的瘾胚期或肠期期胚时，7.52浮性卵，则用口径拍人于脏始的小口吸肾破卵胺，再将胚脂细整收人离心管中；销性胖，则用铲形银于将卵膜挤破-用吸管将胚的细胞吸人离心肾中，了.5.3用吸把胚脆细胞吹打散万，补生梦水至4，～。再加人秋水仙款落减+终浓座为10/ml-50\g/m，置15miu-60min7.5.4低净接7.2.9规定执行，
7.5.5固定、满片、集色分别按*.2.10~7.2.12规定执行B组型分析
B.1床包体整的确定
在油镜下选取～1个分散良好，彤态清晰，激日完粘的裂拒计数每个分裂相的染色休整日，找出染色体激月的众数，并计算众数所占百分比，据此确是鱼的染色体数，8.2缺色体分组和声数的计算
8.2、1鱼类染色压分纠、-股接量比将染色分为四组：a中部节丝粒染危体m组,特比为1. ((1~-]. 7U:4
b）业中部若丝粒染色体sm维，臂比为1. 71 ~3. ）亚端部若丝粒染色体组，肾比为5.01-~7.）端部者丝粒染色体t组，情比为了.1-。CD/T 18654.122002
8.2.2策色件背数（V的计数中部和业部若丝超染色体的使教计为2，亚端部和前操丝粒染色体的数引为1。
8.3染色体分组方法
在油落下选取10--1三个效目完整·分世良灯，长度适当（证中期）落好粒消楚，两条染色单体适强分开，彤态荷晰的分裂相进行是微做摄影。显微摄影的美事顶参见附录B，在照片上用游标卡尺满盘条炎色体的长赔和短臂长度按8.2.二的规定将染也体分组，并按8.2.2的规定确定染色体骨激，得山越型公式，燃后计算得山核型指数，包括嗜比和相对模度。选段其中形态故好，量有代表性的一个分教相分剪下各条策色体，按情比和相刘长度，人小配对，并按m，am，和t组概序排列，每组内染色体按相对长度以人到小排列、贴好、然后翻拍：8.4核型公式
根据对十个以上的中期分刺相染色体测盘分组等分新的结果，就叫确定该种鱼类的策色体数日，染色体分组情况染色体持数和染色林的相殊长。表示这果的表达式称为核型公式。示例某位的核公式为2=48+14+3NF88。8.5其他形态特征的观来
除计数死分组外，还而察染色体的其他形志特征，如有无异形楚色林对，次缴痕，随体等，并计人结果。
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A.1环境条件
附录A
（资辑性附票）
血细胞培养涛
试验操作在无当案或超将工作有下诈行。A.2取样
无茵采止，尾声（款脉来血或心册来而母可.A.3淋巴胞培养
4.3.1用注射器剂离心管整满加肌素滤湿润者壁，支需心管加).1m1.~n.3mL：A.3.2将取有片菌血液的注射游针头圾下，弃量切的2--3滴血，把其余的工液滴人上逆离心管（勿将安池沐滴人）上胶室，4冰籍小静置1左冶·待血较分层，或若将一述装好血液的离心管以30r/min高心3mim-mic，使其统淀分离.A，3.3用剂盘吸管我取31ml.5m，培养流干培差版中，加人淋巴继泡再添加适量增养校通整细胞饿为-->×个/m
A.3.4用注射器按0.1ml/FmL-3.21ml.5ml.培英混滴加PHA，轻格次+1，使培养液和细脂湿约，小用刻度吸管分装，每施b益上瓶盖A.3.5将已拨种的培齐施平放扣显培养第或二氧化碳增养箱（此时监尽量保：专：菌状念并柠松施差内，培养源量袋值的种美不同而有房不向，一般为[8℃>:时间1--5，4大需将培养瓶轻轻密动1~2次：
A.4做量全血培养
A.4.1用刻炭吸管把适盘培养液移人培养瓶内，雨用纯射带滴加1H3车0.：L/=m1.C.2mL/5ml,培葬液，混勾后分装，25ml.培养成每租1.7mL--4.9ml.：+谢避东瓶叫的情少表，A.4.？把取有无菌而液的社射器针头下，排抑最初1~滴血液，2元ml.培养瓶每瓶滴如0.：~.5t向液，壶上盖·帮匀.
1.4.3培按A.3,5的规定执行。
A，5收票细跑、低净，固定，滴片，染包分别按7.2.8~7.2.12现定拟行，附录B
（资料性附）
显学輕影的有关事项
R.1显微概的调节
B.1.1指10特人光路中，证节以日镜简使两日镜前距商符个使用者两限回的高，可书避焦亚景日没光度视小谢节坏必证点标志或索洁晰：然后用粗继极点钮把标本的像谢焦清晰6
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B.1.2聚光懿调中，关小规场光栅，升降案光使所好到范多边形的秘期光批像清晰，耳用案光镜上的调牛族针将视场光册调全视衡中火，开大视场光烟后世一业阅中至与视好困流内接，带续开大光栅车野外坊，即稍大于视要
，1.3将孔轻谢开至与物镜的数偿孔轻（N：A>相应有：般情出个，率光榜的几径光初应比物貌的孔独光栅小一分之一左有，才能我得最好质量的象。谢换物镜时孔径光想也必须相应调整（聚光镜与物点教值孔径的匹！足导微抵影的关性样作），B.1.4再把标本描确调焦后即可准备拍斑，B,2黑白感光片及相的选择
般黑凹感片次21\，为券高反差理议快用1左付为致誉，懂用4号相氧。
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