【国家标准(GB)】 游泳池水微生物检验方法大肠菌群测定

GB/T18204.10—2000
为贯彻执行《公共场所卫生管理条例》和GB96639673--1996、GB16153—1996《公共场所卫生标准》，加强对公共场所卫生监督管理，特制定本标准。本标准中的方法是与GB96639673-1996、GB16153—1996相配套的监测检验方法。本标准第一法为仲裁法。
本标准为首次发布。
本标准由中华人民共和国卫生部提出。本标准起草单位：天津市卫生防疫站、中国预防医学科学院环境卫生监测所、江苏省卫生防疫站、北京市卫生防疫站、广东省卫生防疫站。本标准主要起草人：张淑兰、陈西平、路金爽、封幼玲、高晖。34
中华人民共和国国家标准
游泳池水微生物检验方法
大肠菌群测定
Methods of microbiological examination for water in swimming pool-Determination of Coliform bacteria1范围
本标准规定了游泳池水大肠菌群的测定方法。本标准适用于游泳池水大肠菌群的测定。2引用标准bZxz.net
GB/T18204.10-2000
下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。GB/T18204.2—2000公共场所茶具微生物检验方法大肠菌群测定3定义
本标准采用下列定义。
大肠菌群coliformbacteria
指一群在36℃土1C培养24h能发酵乳糖、产酸、产气的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
第一法
多管发酵法
4仪器
见GB/T18204.2--2000中第3章。5培养基和试剂
5.1乳糖蛋白陈培养液
5.1.1成分：蛋白陈
牛肉膏
氧化钠
1.6%(V/V)溴甲酚紫乙醇溶液
蒸馏水
三倍浓缩乳糖蛋白陈培养液按上述乳糖蛋白陈培养液浓缩三倍配制。5.1.2配法：将蛋白陈、牛肉膏、乳糖及氯化钠置于1000mL蒸馅水中加热溶解，调pH到7.2~7.4。国家质量技术监督局2000-09-30批准2001-01-01实施
GB/T18204.102000
再加人1mL1.6%甲酚指示剂，充分混匀，分装到含有倒管的试管中，115℃高压灭菌15min。5.2伊红美兰琼脂
见GB/T18204.3-2000中第4章第2节。5.3革兰氏染色液
见GB/T18204.3--2000中第4章第4节。5.4染色法
见GB/T18204.3—2000中第4章第5节。6推测性试验
6.1在2个装有50mL三倍浓缩乳糖胆盐培养液的大试管或烧杯内各加人水样100mL。6.2在10支装有5mL三倍浓缩乳糖胆盐培养液的试管里各加人水样10mL。6.3轻摇试管，使液体充分混匀，置36℃士1℃培养箱中，培养24h6.4观察每管是否产气，如不产气则报告为大肠菌群阴性；若有气体产生则为推测性试验阳性，需做进一步的证实试验。
7证实试验
7.1平板分离
自推测性检验阳性管中取一接种环培养液，接种到伊红美蓝琼脂平板上，置36℃土1C培养箱培养18～24h，观察菌落形态，典型的大肠菌群菌落为黑紫色或红紫色，具有金属光泽。7.2复发酵试验
挑取可疑大肠菌群菌落1或2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，于36℃土1℃培养箱中，培养24h。
7.3凡乳糖发酵管最终产酸、产气，革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，为大肠菌群阳性。记下证实试验的阳性管数，查总大肠菌群（MPN）检紫表得出1000mL水样中总大肠菌群的MPN值。表1总大肠菌群（MPN)检索表
100mL水量的阳
性管(瓶)数
10mL水量
的阳性管数
8仪器
8.1滤器。
每升水样中
总大肠菌群数
第二法
每升水样中
总大肠菌群数
每升水样中
总大肠菌群数
GB/T18204.10—2000
8.2滤膜：孔径0.45μm。直径根据滤器规格，日前常用的有35mm和47mm两种。8.3抽滤设备。
8.4无齿镊子。
8.5其他仪器见GB/T18204.2-2000中第3章。9培养基
9.1品红亚硫酸钠培养基
9.1.1成分：
蛋白陈
酵母浸膏
牛肉膏
磷酸氢二钾
无水亚硫酸钠
10~20g
5%碱性品红乙醇溶液20mL
蒸馏水
9.1.2储备培养基的制备
1000mL
将磷酸氢二钾、酵母浸膏、牛肉育及蛋白陈加到含有900mL蒸馏水的烧杯中，溶解后调pH值到7.2~7.4，加人琼脂加热溶解，用蒸馏水补足至1000mL，趋热用脱脂棉或绒布过滤，再加人乳糖，混后定量分装于烧瓶内，115℃高压灭菌20min，置冷暗处备用。9.1.3平Ⅲ培养基的制备
将上述培养基加热融化，根据培养基的用量，碱性品红乙醇溶液与培养基按1，50的比例，用灭菌吸管吸取一定量的碱性品红溶液置于灭菌空试管中。再按1：200的比例称取所需的无水亚硫酸钠置于另一个灭菌空试管内，加灭菌水少许使其溶解，在沸水浴中煮沸灭菌10min。用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液至深红色腿成淡粉红色为止。将此亚硫酸钠与碱性品红的混合液全部加入已融化的储备培养基中，并充分混勾（防止产生气泡），立即将此种培养基适量倾入灭菌的空平皿内，待其冷却凝固后置冰箱内备用。此培养基于冰箱中保存不宜超过两周，如培养基已由淡红色变成深红色，则不能再用。9.2乳糖蛋白陈培养液
见5.1。
10操作步骤
10.1滤膜灭菌：将滤膜放人含蒸馅水的烧杯中，煮沸灭菌三次，每次15min。前两次煮沸后需更换水洗涤2～3次，以除去残留溶剂。10.2滤器灭菌：用121℃高压灭菌20min或用点燃的酒精棉球火焰灭菌。10.3水样过滤：用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，贴放在滤床上。固定好滤器，将100mL水样（如水样含菌数较多，可减少滤水样量或将水样稀释）注入滤器中，打开滤器阀门，在一0.5X105Pa（一0.5大气压）下抽滤。10.4培养：水样滤完后，再抽气约5s，关上滤器阀门，取下滤器。用灭菌镊子夹取滤膜边缘部分，移放在乳糖琼脂分离培养基上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与培养基完全贴紧，两者之间不得留有气泡。然后将平血倒置，放人36℃土1℃恒溢箱内培养18～24h。10.5挑取滤膜上符合下列特征的菌落进行革兰氏染色、镜检。37
紫红色，具有金属光泽的菌落；GB/T18204.10-2000
深红色，不带或略带金属光泽的菌落；淡红色，中心色较深的菌落。
10.6将革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌接种到乳糖蛋白陈培养液中，于36℃土1℃培养48h。产酸产气者证实为大肠菌群阳性。
11检验结果报告
计算滤膜上生长的证实为大肠菌群的茵落数，再乘以10即为每1000mL水样中的大肠菌群数。38
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