【国家标准(GB)】 植物检疫 小麦矮化腥黑穗病菌检疫鉴定方法

ICS 65. 020
中华人民共和国国家标准
GB/T 18085--2000
植物检疫
小麦矮化腥黑穗病菌检疫鉴定方法Plant guarantine-Methods for inspeclion and identificatiorofTitietin controverseKthn
2000-04-26发布
2000-10-01实施
国家质量技术督局发布
GB/18085—2000
小变糖化晖黑病凿(rileriacontroersaKehn）是我国逆境植物检疫危险性游害，为工防比该植物来原菌随小麦、大麦、黑竞和其他有土植物种子待入我压，在进境植物控这时需正确掌国小表接化腥黑穗病阐的检疫和鉴定与法
本标准在制定过得中，总站了多年措物检的实战经龄，资收了更环单内的最新研电成界，恨拥小支矮化哦黑端病菌的形态学特芷，自发丧光是微学特征礼萌发生理学等征，确定丁检疫和晚定小斑矮化腥需覆病菌的各项技术要求：本标准内附录人是标准内求。
术标准出农业部提出。
本标准负安起草单位，卡华人民其和国大追出入境检整检疫局。本标准参加起草单位：中华人民共和国国家山入境检验检疫局、中华人民儿和国上海出入境检验检短局。
术标准越草人：影金火，盘心，周同桑，毛志农，劳冠中华人民共和国国家标准
植物检疫
小麦矮化黑穗病菌检疮鉴定方法PlantyuarantineMethody forinspcetion and idrnlificationof Tileria caatroversa Kuhn
本标准规定了让境植物检疫中小去梦化服黑端病案的检变和然定送。GB/T 180852000
本标准适开进口小麦、人麦任黑安中小麦矮化限黑秘病菌的检疫和鉴定。2定义
本标准采用下列定义
2.1样品sample
2.1.1原始样品ariginalsatpl
在现场各点抒取的性记。每份源始样晶的质量应不少于51g。2.1.2样品ie
末经充分减对的原始件张路总和。每份基合格站*质母应少于15002. 1. 3中的详品average samrle命单品经多分混个均今后的样品。2.1.4式验详品lest st:[rEle
从平均品中球取的，用于洗深离心的评站，每份试龄书品的质量为0。2.1.5保存详品kaepsanple
退走试验品用大保存么各复始行载的剩会平与样品。保学样品软质量不少于002.？网咨高值e=culumacight
冬抱于外胞壁的垂直病度值·负光学显微镜一表现为冬拖子外跑强的必状或齿状突起的垂直高度值，
2.3临养两背高度数值thresholdof reticulumheigiar来确宗单个冬跑子厚性的网肾高度信，其效值为u.5m。3原理
小麦化腥黑速病菌是危害左类标物的一冲扭子南，端子南业（Baaidiomycotinr），冬泡菌纲(leliomyceres），黑粉菊日（Usuilaginales），黑虚科TilleareBe），黑粉菌属（Tiieria）。病原连生支类作沟声期形成系落长张，被偿染作物结实时，格粒披病菌的紧整体一一冬独子促占成为菌离，该病原菌的冬孢子形态学待征，已发荧光显微学特征和剪发生理学导江与其他腥黑粉病菌不问，是鉴定该病原菌的依站。
3.1冬泡子形态特征
国家度量技术监督高2000-4·26批滑2000-10-01实施
3. 1. 1冬孢子
GB/T 18085-2000
小克婚化哦黑势病随的冬独子尽球形，拖形或不则形，是网状谢纹杠无色到锁色的胶质鞘直径（含胶质销）为16.80um~33.19m,通索为18m-24um务准了勇发适宜温度为2C--8:剪发时均感先菌丝（担），在其删端产生初生小炮广（担饱子），初生小跑子经\H\形交配产生新月形次生小孢广。
3. 1. 2网许息送值
该特征是小矮化程黑愧病前和其近似种—小友网黑穗病菌（Teriaraie:Tur.）冬恼子最重要的区别等证前者内习当高值平均值上标准差）为1.43u-3.14m,后考为3,3m士c. .9 μr.
3.1.3估并两背高准指数值
当基个冬独了范网游高度值大于（叫时，现为小麦矫化眼黑糖病南冬孢了，小于等于r.H5um时，现为去网腿黑速病面签孢了3.2冬危了前发荧光显低举持征
在搬发滤光件435nm.屏障滤光片52nm的激发下，小麦化腥黑愧病菌-冬孢子3msim内可产生自发炎光，其迟似种小变网服黑秘病商不尺备该能力。3.3落孢7鞘发
小楼北腥黑谢病陷冬泡子在5心消发，1了七不能萌发，而小交网盗照糖据菌冬他于在5和17℃与可发
4仪器设备
4.1能显微镜：具落射求灯装配，据像转热器及收规器4.2滤光片纠.450~450m激发，2m群摩。4.3日镜和镜台测微尺。
4.4社复式掌荡器。
4.5低连离心机.
4.6下热灭消器。
4.7亮压天菌器。
4.8通大半：感盘1/100
4.9超许工作存.
4.10牛物培养箱;具照低温可调至5T4. 11
可教量5200。
一角烧瓶：25cmL：
4.13离心，m.或2Umf.
4.14培养血：直径9rm。
4. 15载肢片: K宽为2. 4 ttmx76. 2 ma,厚 c. B mm,4.16
盖玻片:12mm×18ml.
孔筛：长乳筛直经2U孔径1.×2nm孔筛直径20cn1.孔径2.5mm4.17
4.18Pa:arlr膜或妈铅纸.
5药品
盼非另作说明.以下药异的沌宽均为化学纯5.1次氯酸钠落液或激凹粉精片，5.2叶满-24ween-20).
GB/T18C85—2000
5.3常尔片浮载剂.也可启下违药品配制（见所案A）5.3.12酸钾(HCOOK)
5.3.2甘油CHOHHOHHOH
5.332醇()。
5.3.4柠微腔(CH,O:)
5.3.5中醇(CH,OH).
5.3.6磷龄氢二钠（Na,HPO,)，
5.4青高案、斑荐索（医月射粉剂。5.5京脂粉，
5.6无丧光显微遗物说镜头油(Vd=1.16:5.7永久断片剂。
6现场检疫
6.1卵运龄装贷物书质始样品的杆取利合详品的制色船运散装小变、太菱，黑和其他小麦燃化胆黑秘病由的奇主植物籽粒分整别、分层次、分品种、分等级按供盘式选点--点打收成始样品并制成复合样品。必要对，最样点可游至90个，复合详品为量一增举4500，用一次性塑料整盛放样品。以其他方式进口的小左、大左、黑在和其他小变矮化喔黑糖病菌的声土植物籽粒（含种质资源)以车，车波就其位装为堂送，取1份复合样品，其余接照本标准执行。6.1.1第次取择
卸货的车幸层进行。
6.1.2卸贷谢间取样
换1000！货物托取，调备一份复合样品.6.T.3找站登记
扦取的样品必须登记登证项日包担船名，发贷港、原产地、品种及等级，舱别和层次，拆样时问，样品编号、汗样易效名等。
6.2随腰检查
在中害杂草检验时同时进行。
6.7.1获取游下构
左纤取原价样品的同时，每点至少另取2MM样品至孔筛进行筛检，每筛旋转(10~2C>次，弃筛上动，留许下物，
6.2.2排菌螂
仁纽检告筛下物中件无可既医整降块：如有，编号装管，带回实验室制片镜控，必要时，将筛下物虏同实验室作述一步控查。
7实验查检验
7.1制备平均样助
在样品预处理家内将安1。1涤获取的务个款合样品在原托样袋中分别充分海匀，制成平内栏品7.2样检验
从按7.1系制成的各平栏品取作为试险性品。7.2.2和离心。
7.2.2.1 加水
GB/T18085—2C00
格试登样品野人整热灭菌（1：1.5后的25m.三角烧瓶内，蒙水7再洒表面活性剂吐温-3012滴。
7.2.2.2封口
用钻钜纸或Harafilm膜将三角绕并封口。7.2.2.3无满洗涤
将三角烧折觉在年复式器上满洗谈5mia7.2.2.4离心www.bzxz.net
立即取下三虑瓶，将洗涨评液洋入绝千热灭南的20刻寓心管内，1/mir良心3min
7.2.2.5泥合离心
取出商心管，倾去上消波，半加测余洗涤忠浮液·语合离心，直率所有造涨悬波离心光毕，留尔淀物
7.2.3定裕
在沉淀物中加乐氏浮载使之净，现沉淀物多定将空1L～3，7.2.4制片
用可源做最加择吸取5～2流凝物悬浮波至载城片上，益我片，司片用沉物浮液的体积以加盖表片后忌浮液本溢为宜，7.2.5蒙效
每分试验样品的沉淀物率液至少镜捡5张玻山，每片按摄野依次全检者：7.7.6同虚
如发现可数小变般化强惠穗病菌冬拖子.驱机测量31个段驾冬独了扩可窄高度值，测年应在油航<100×）下进行（见8.1条，如测匠5张效片后仍不30个多它子.增划玻片按查数量，直至所右沉淀物学波，
7.3谢澳险奇
如发现腥黑扮菌菌嗯，到取少许冬范子安适世帝尔氏设镜检，作刺步鉴定。如怀做是小接化朋崇穗病苗，恢7.2.6条对冬独了述行测主，鉴定方供见第8章，绪果证定见9.3杀，8整定方法
81冬施子形态学鉴突法（见3条和7.名6条）道过油镜在现器屏等上（或用日镜刚微尺)对每入冬子按上下左右随扩地测量4个网管高查并求出平均网资高需值，用孩平均网脊高度值代友该冬独于的网将高度值逆行鉴定，如发现菌续，还需求出随对测量的301个成熟冬泡子的平均网当更值：B.2冬独子白发荧光显徽学监楚方法（见3.2）效现荫学即使用木方法，
8. 2. 1 制片
从菌读上部取少许条跑子粉至静的板寂产.上，加适盐蒸遇水制或冬孢了芯产液（浓度以10×1CC倍下每规野不超过10个冬抢了为宜），整于防尘处江其自然于燥，然后在十燥并附举十藏玻片的冬子划-一滤无荧光显微等物镜锻头润+扫蓄玻片，再期上达镜油。8.2-2造拆滤光片组
将制好的载片置」激发滤光片4m屏产燃元片52Jsm的落封装光能显激宽上8.2.3计时和计效
谁忘观案视墅，同时开始计时。每规野黑射3.5mir：后开始检食规买中呈月发荧光正反应和负反应的冬孢于数：全过程不得超过3min，4
82.4计算白发蒙光分率
GR/T18085—2000
每份菌婴禅品至少规穿5办视野、200个冬跑子，然后计算呈亡发卖光正反虚多他了的背分率，以该白分求少表该莲遵范自发茨光率进行些定，8.3冬他子期发生厚学鉴定达
当发现菌离，止形态学和自农荧光显微学不能正确酱定时，可根据这两种睡黑感病菌冬难子在、17益度下不可的情发特性作鉴定，8.3.1制平放
3%的水球脂经尚规有巨提热灭菌片冷却至50左右，倒入直径9cm的培差血内，每皿20mL：制平板时需赖止形成表面流动示：83.2资版
取部分菌塞列道虽灭菌需水制成冬独子整浮，均沟地涤在水掠脂义板上，冬狗子悬浮统的浓盘以低溶（×)下每现野40个～6冬了为宜。83.3培荞
将涂有冬子的平板官35土1私-7士1，有连续（成与18h黑略交替光照的条件下进行培养。
8.3.4观案利观察村间
在显微镜1×10）下现赛冬饱子的肯发：第1欣观案可企培兼10天时进行，后每隔3天～7天现察次，记录调发精况并计解消发率。9结果评定
9.1末发脱菌燃
9.1.1未发现网肾高康假大于临界网举高度指数值（0.95m)的冬泡了，规为.不带小变续化强黑制病9.1.2在该货物的任，验单品的沉淀物总泽液中.随机测且的个成熟冬孢子中有可脊高度偿大丁临界网冷商度指效值关可心麦化懂需独病菌冬弛于时，应进一步检查。9.2发现楼
9.2.1曲澳的30个或冬范子的网节商度平均值大于或等十二.43m时.遗定为小变矮化醒黑病苗：
9.2.2菌离的30个成效冬跑子的下均网考高度值小于或半」0.73am时，菌爆不量小素然化腥黑愁病荫。
9.2.3菌率的3个成数冬范子的网肾商度均值为C.71Mm~1.42um9.2.3.1菌腰冬拖了自发荧光率大于载等」80为附苗惠定为小磷化腿黑感病鼠9.2.3.2菌燃么难干自发必并小于或等干30为时，菌巢不是小老频化避黑德病菌。9.2.3.3前费安他于自发荧元率为31%~79%：9.2.3.3.1=:下面发，17下不勇发，菌燃定为小麦化瞬黑独病苗。9.2.3.3.2℃和17下购可前发菌害天是小麦矮化游黑体病菌。10样品的保存
保存详品应按胎别、层次、品种、等数分别在放。保存样品经登记和照手人等字启登低银干频、防虫防鼠处要保存2个斗，加发原小麦额化腥黑糖病菌，该样至少需保存《个月，以各复验、淡判式件裁，保存期满后，带经灭菌妇理5
壶克凡氏缇冲
A1.1配制0.1mol/1.的柠蒙酸溶液GBT180852000
附录A
（标准的对录）
席尔氏浮献剂的配制方法
称吸19.21无水柠惊激落三511ml.蒸水中，醇至1000r：甲醇可甲蒸泄水代梦。A1.2配制0.2 mal/l.闪磷酸氢二的碎液你取28.40元水磷膜氢二销落500录谢水中.加平藓至19m：中醇可用热馅水代势，A1. 3说合
取n. 1 mal/T.的宁酸溶液5. 5 ml. 和1. 2:nml,/1.的磷酸氢一射竿液194. 5 ml.混合,即可得pH为的索克凡氏娱冲。
2席尔氏浮剂的配制
取6g无水乙酸钾磨于3Mal.克凡强冲中，汕t20ml.杠Z醇8mT.混划即成席尔民浮较剂。
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