【国家标准(GB)】 植物检疫 烟霜霉病菌检疫鉴定方法

GB/T18086—2000
烟霜霉病是我国进境植物检疫危险性病害，为了防止该病菌随寄主传入我国，在进境检疫时，需正确掌握烟霜霉病菌的检疫鉴定方法。本标准在制定过程中，经过调查研究，分析有关资料和总结多年的实践经验，以及根据烟霜霉病菌的生物学特性、病理学原理，确定各项技术指标。本标准给出烟霜霉病病原菌的孢囊梗和孢囊及卵孢子的形态特征，两者可同时或单独作为烟霜霉病菌的鉴定依据。
本标准的附录A是提示的附录，附录中的“冰冻匀浆法”是检验烟霜霉病菌卵孢子的一种较先进的方法，但目前在国内尚未普及，故在检验烟霜霉病菌时，若条件允许，也可采用此法检验该病原产生的卵孢子。
本标准由农业部提出。
本标准负责起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：李怡珍、章正、钟国强、张传飞。305
中华人民共和国国家标准
植物检疫
烟霜霉病菌检疫鉴定方法
Plant quarantine-Methods for inspection and identificationof Peronospora hyoscyami de Bary f. sp. tabacina (Adam) Skalichy1范围
本标准规定了进境植物检疫中对烟霜霉病菌的检疫鉴定方法。GB/T18086--2000
本标准适用于进境干烟叶和烟属植物种子、种苗的烟霜霉病菌检疫和鉴定。2原理
烟霜霉病菌为专性寄生菌，烟叶被侵染为害后，出现边缘模糊、褪绿的近圆形斑点，后期形成淡褐色可脱落的坏死病斑。在适宜温湿度条件下，叶背面病斑长出淡蓝色霉状物，即烟霜霉病菌的孢囊梗和孢囊；在一定条件下，病组织内可形成卵孢子。病原菌的寄生专化性及其形态学特征是鉴定烟霜霉病菌的依据。
3仪器、试剂
3.1手持扩大镜。
3.2带光源的扩大镜
双目解剖镜（10×～50×）。
3.4显微镜（100×～1000×）。3.5离心机（1000r/min～4000r/min）。3.6不锈钢筛（孔径60 μm）。
3.7振荡器（200r/min）。
3.80.02mol/L磷酸缓冲液（pH一7)。3.9苯胺蓝。
3.10乳酚油
乳酚油配制：苯酚结晶（水浴加热溶化）20mL、乳酸20mL、甘油40mL、蒸馏水20mL混合而成。3.1110%氢氧化钾溶液
氢氧化钾溶液配制：取氢氧化钾10g，加水90mL溶解配成10%氢氧化钾溶液。4抽样
4.1抽查取样前查验待检烟叶的有关单证，核实产地、包装、唛头、品名、级别、收获年份及数量。4.2用随机方法在货柜车、船舱、仓库堆位的上、中、下各层开件抽查，检查包内烟叶是否有可疑疫情随机在包内的各个部位取样，注意抽取等级差、叶色暗淡无光泽的烟叶带回室内检验。4.3抽查件数
国家质技术监督局2000-04~26批准306
2000-10-01实施
GB/T18086-2000
按货物批量总件数0.5%～10%开件抽查取样，500件以下的抽查20件，少于20件的全批抽查。其余开件抽查件数如表1：
表1进境烟叶检疫抽查表
批量总件数，件
500以下（含500件）
501～1000
1 001~3 000
3001～5 000
5 001～10 000
10.001以上
4.4取样质量
抽查件数，件
21～~30
51～70
71～100
香料烟、打叶片烟每批取样6kg~15kg。扎把烟每批取样20kg~40kg。4.5烟属种子、种苗的抽样每批按总件数的5%~~20%抽查，种子每批取样检验20g~~50g，种苗每批取样检验100株以上，少于100株的全检。5烟叶检验方法
5.1病叶检查
在光线充足处，逐片检查烟叶有无烟霜霉病的可疑症状，叶背有无灰褐色的霜霉层。5.2病原菌检验
5.2.1直接镜检
用解剖针挑取病斑上的霉状物制片镜检，用显微镜观察有无病原菌的孢囊梗和孢囊，记录其形态特征，必要时测量孢囊梗的长度和孢囊的大小。5.2.2洗涤检验
将未发现霜霉层的可疑病斑及碎片，置250mL三角瓶内，加入适量蒸馏水漫软后，用振荡器激烈震荡5min，洗下病斑表面的病原物，将洗涤液倒进离心管，以1000r/min离心5min，倾去上层清液，取沉淀液置载玻片上，盖上盖玻片，用显微镜检查有无烟霜霉病菌的孢囊梗和孢囊，每批样品至少检查10个玻片。
5.2.3叶组织透明法检验卵孢子
选取病叶上霉状物稀少的老病斑置于小烧杯中，加适量10%氢氧化钾溶液（或其他叶组织透明试剂），煮沸5min～10min至叶组织透明，加0.05%苯胺蓝（棉蓝）乳酚油作浮载剂，置显微镜下逐片观察有无卵孢子。
5.2.4冰冻匀浆法检验卵孢子（见附录A）5.3样品的保存
经检验完毕的大宗烟叶的样品，香料烟、打叶片烟等每批留样1kg～2kg，扎把烟每批留样2kg～4kg，注明烟样的合同号、产地、品名、级别、收获年份、抽样地点、时间等项目后分别存放于干燥、防虫处保存2个月。发现有烟霜霉病叶的样品，至少保存6个月，以备复检、谈判和仲裁。保存期满后需作灭菌处理。
6烟属植物的种子、种苗检验方法6.1种子检验
随机选取种子10g~30g（含种子中夹杂的残株碎屑），用5.2.2条方法洗涤检验（该方法主要检验307
GB/T 180862000
夹杂在种子中的残株碎屑是香带烟霜霉菌的孢翼梗和孢囊）。6.2种苗检验
检查种苗叶片背面有无烟霜霖病症状，如有霜霉层，可用5.2.1条方法镜检病原的孢囊梗和孢囊，对可疑烟苗，须作保湿检查：将可疑烟苗叶片展平，放入预制的直径15cm～20cm铺有3层湿滤纸的玻班中，加盖后形成小型湿塞，置18C下无光照诱发培养12h24h，然后在双目镜下仔细检查有无新生的烟霜霉病的孢囊梗和孢。
7鉴定特征
烟霜霉病菌的孢囊梗无色，从寄主气孔中伸出，主轴较粗壮，上部呈双叉分枝3次一10次。孢囊梗长400um-750um，宽？um-11um分枝角度越分越大，末枝皇钝角分叉，叉枝基部略粗并向末端变尖，两叉技长短略有差昇，较长的枝常弯曲，另-枝较真，末枝长？m～14um：孢囊在未校顶端同步形成，易脱落，无色或淡黄色，柠檬形或卵形，无乳头状突起，大小为（17um～28um）×（13m~17um）。孢囊壁薄，厚度均匀。烟霜霉病菌的卵孢子壁与器壁分离。成熟卵孢子呈桔黄至红褐色，球形，直径为20um~60教m，外胞壁常有瘤状饰纹。
8结果判定
从烟叶上发现的霜霖病菌的孢囊梗和孢囊或卵孢子，符合上述形态特征的可鉴定为烟霜霉病菌。308
A1原理
GB/T 18086-—2000www.bzxz.net
附录A
（提示的附录）
冰冻匀浆法检验卵孢子
烟霜霉病菌的卵孢子产生于病叶的组织内，病叶经冰冻匀浆使大多数叶肉组织、气孔细胞及维管束组织破碎，而卵孢子仍完整，通过网筛过滤、离心匀浆液，可收集较高浓度的卵孢子。A2方法
取直径为1cm烟霜霉病病斑或可疑叶碟，称量，每0.1g叶碟（约含叶碟15个～20个），加磷酸缓冲液（pH=7.0,pbs）2mL，用玻棒搅拌，在室温下静置15min，放入一18C冷冻室内速冻2h，取冰冻叶碟移入匀浆器内，加(1～2)mLpbs冲洗，匀浆4min～6min，用孔径为60μm的不锈钢网筛过滤，并不断冲洗筛网，收集滤液。以1000r/min转速离心3min，倾去上清液，加乳酚油定容至1ml，每批样品至少检查10个玻片，记录卵孢子的数量。309
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