【国家标准(GB)】 化学试剂 氨基酸测定通则

UDC54-4
中华人民共和国国家标准
GB/T13648—92
化学试剂
氨基酸测定通则
Chemical reagent
General rules for the determination of amino acids1992-09-01发布
国家技术监督局
1993-07-01实施
中华人民共和国国家标准
化学试剂
氨基酸测定通则
Chemical reagent
General rules for the determination of amino acids1主题内容与适用范围
GB13648—92
本标准规定了氨基酸含量、熔点、比旋光度、层析试验和灼烧残渣测定的通用方法。本标准适用于氨基酸及其衍生物的分析。本标准不适用于药用氨基酸的分析2引用标准
化学试剂滴定分析(容量分析)用标准溶液的制备GB601
GB603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备GB608
GB6682
GB9008
GB9741
一般规定
化学试剂氮测定通用方法
化学试剂比旋光度测定通用方法化学试剂熔点范围测定通用方法实验室用水规格
液相色谱法术语柱液相色谱法和平面色谱法化学试剂灼烧残渣测定通用方法3.1本标准中所用的水，在没有注明其他要求时，应符合GB6682中三级水的规格。3.2本标准中所用试剂的纯度应在分析纯以上。3.3本标准中凡层析测定时，氨基酸的R值均应以在完全相同条件下的标准样品或工作标准样品的R，值为判断标准，且每次测定时都不得省去作为判断标准的标准样品或工作标准样品。3.4本标准中凡层析测定需做杂质限量检测时，应使用符合6.1.2.2条规定的工作标准样品。4熔点测定
按GB617之规定测定。
氨基酸的熔点数值可参考附录B(参考件)。5比旋光度的测定
按GB613之规定测定。
氨基酸的比旋光度数值可参考附录B(参考件)。DL型氨基酸的比旋光度应控制在0士0.5°范围之内。国家技术监督局1992-09-01批准1993-07-01实施
6层析试验
GB13648—92
层析试验用于检测氨基酸的纯度及定性鉴别。所有氨基酸均应从下列方法中选择一种方法进行测定。
6.1纸层析
6.1.1方法原理
纸层析法是以滤纸为情性支持物的一种层析法。分离原理属分配层析的范畴，它利用不同溶质在静止的水相，亦即纸上所吸附的水为固定相和沿纸流动的有机相（即流动相）两相溶剂间的不断分配而达到分离的目的。氨基酸经层析后，常用比移值(R)来表示各组分在层析谱中的位置。R：值按式(1)计算：R
式中：R，—比移值，
d，一溶质迁移距离，cm
dm—一流动相迁移距离，cm。
+.（1）
在一定的条件下，同一氨基酸的R，值是一定的，但由于影响R，值的因素较多，一般都采用与标准物质对比，即根据试样与标准物质在层析谱中R：值来进行鉴别，并可根据显色后杂质斑点的多少和色量来确定试样纯度。
6.1.2试剂及材料
6.1.2.1标准样品
纸层析和薄层层析用标准样品，纯度不小于99.5%。6.1.2.2工作标准样品
须经标准样品验证，主体含量不应少于98.0%。6.1.2.3层析用纸
层析用纸是指具有一定强度，质地均匀平整的纯棉浆制成的滤纸。纸的裁切方向应使流动相能顺着纹理方向移动。定性用的层析滤纸灰分须小于0.1%。般可选用新华一号层析滤纸。
6.1.2.4显色剂（常用显色剂）
称取4g节三酮（苯骚戊三酮），溶于1000mL乙醇（无水）中，置于棕色瓶内保存。节三酮除对脯氨酸和羟脯氨酸产生黄色外，其他氨基酸均产生紫色。氨基酸的特殊显色剂可参照附录C（参考件)。6.1.2.5展开剂
展开剂可参照附录A（参考件)之规定使用前制备。必要时可选用其他展开剂。
6.1.2.6展开室
可选用大小适宜的标本缸。
6.1.3操作步骤
取新华一号层析滤纸，长30cm，离底边2cm处用铅笔划一直线，在直线两端2cm处开始点样，点与点之间距离为2cm，点样扩散的直径不超过0.5cm。每点下面须用铅笔注明试样的名称和点样的量。同一张层析纸上可点数个试样，纸的宽度取决于试样的数目，并留有点标准样品或工作标准样品的位置。
称取0.005g氨基酸试样，精确至0.0001g。溶于0.5mL水或盐酸溶液[c(HC1)=0.5mol/LJ中，稀释至5mL。用微量进样器或微量吸管点样，每次点样后须用冷风吹干，点样量按检测要求不少于5μ，不多于10μ，即相当于50μg和100μg。氨基酸纸层析一般上行即可，可将已吹干的层析纸两边卷成圆筒状，用二根塑料丝上下固定。在一2
GB13648—92
高为36cm的标本缸内平放一培养血，内盛高度为0.5cm的展开剂，将层析纸置于缸内以展开剂的饱和蒸气平衡2至4h后，试样端朝下放入培养血中，盖紧玻璃盖。展开12至16h后，流动相前沿即可上升27至29cm，此时将层析纸取出晾干或50℃干燥，按6.1.4条之规定显色。6.1.4显色
将已除去溶剂的层析纸喷以显色剂，冷风吹干后于50～60℃保温15～20min即可显出有色斑点。6.1.5结果的确定
6.1.5.1以100μg点样量，按规定展开并显色后，只显出一个斑点，且与标准样品或工作标准样品的R：值一致即为层析试验合格。
6.1.5.2以100μg点样量，按规定展开并显色后，除显一个主斑点外，其他氨基酸的斑点小于或等于按产品规格规定制备的杂质标准的斑点时，即可确定含其他氨基酸小于或等于标准。6.2薄层层析
6.2.1方法原理
薄层层析是一种将吸附剂均匀地铺在一块玻璃板上形成一薄层，在此薄层上进行色层分离的一种层析法，按分离机理可以分为吸附、分配、离了交换、凝胶过滤等法。本标准主要使用吸附薄层层析法。6.2.2试剂及材料
6.2.2.1标准样品
应符合6.1.2.1条之规定。
6.2.2.2工作标准样品
应符合6.1.2.2条之规定。
6.2.2.3硅胶G
本品系白色均匀细粉，粒度平均在10～40μm之间，含有约13%的半水硫酸钙。本品应符合下列分离要求：各取0.040g二甲基黄、苏丹Ⅱ、靛酚蓝，溶于100mL苯中。取2μL，点样于按6.2.3.1条之规定制备的硅胶G板上，用苯展开10cm，色谱图应显示三个清晰的分离斑点，靛酚蓝斑点接近于起始点，二甲基黄在色谱图的中央，苏丹Ⅱ介于二者之间。6.2.2.4纤维素粉（微晶形）
本品为白色均匀细粉，平均粒度小于30μm。本品应符合下列分离要求：各取0.025g亮黑、鸡冠红、快黄、金莲橙，溶于100mL甲醇和水的混合溶液（1十1)中。取10uL，点样于按6.2.3.1条之规定制备的纤维素板上，以丙醇+乙酸乙酯+水的混合溶液（10+1+4)为展开剂，上行10cm，色谱图应显示四个清晰的分离斑点，即黑色斑点、红色斑点，两个黄色斑点，R值依次增加。6.2.2.5展开剂
应符合6.1.2.5条之规定。
必要时可选用其他展开剂。
6.2.2.6显色剂
参照6.1.2.4条之规定。
6.2.3操作步骤
6.2.3.1制板
制备薄层板所用的玻璃板必须表面光滑、清洁，其大小可根据需要选择，小的可用载玻片，大的可裁成20cm×20cm的玻璃片。
取一定量的吸附剂（硅胶G可按25~30g加60~65mL水：纤维素粉可按8g加48mL水，2mL乙醇)在研钵中加水调成糊状，按玻璃板的尺寸取一定量的吸附剂糊均勾地铺成一厚度为0.2～0.3mm的薄层。若使用涂铺器可按制造厂商推荐的方法涂铺。铺成的薄层须置于水平台上室温干燥过夜。
硅胶G制板的时间从调糊状到铺板不应超过1.5min。3
GB13648—92
氨基酸及氨基酸衍生物应使用在空气中干燥(不经过加热)的薄层板。市售的预制板经6.2.2.3条或6.2.2.4条试验符合分离要求的亦可使用。6.2.3.2点样和展层
取薄层板一块，在距底边1.5cm处开始点样，点与点之间的距离为1.5cm，点样扩散的直径不超过0.2cm。如需多次点样时，可用冷风将第一次点样吹干后，再点第二次。试样称取、溶解及点样用的器具应参照6.1.3条之规定。
薄层层析可选用大小适宜的标本缸。薄层板浸入展开剂的深度不超过0.5cm，上行至流动相前沿离顶端0.5cm处（展开距离一般不超过15cm）取出，在50℃干燥除去溶剂。6.2.3.3显色
将已除去溶剂的薄层板喷以显色剂，冷风吹干后于50～60℃保温15～20min即可显出有色斑点。6.2.4结果的确定
应符合6.1.5.1条及6.1.5.2条之规定。7含量测定
氨基酸的含量通常可按下述两种方法之一进行测定。7.1氮测定法
按GB608之规定测定。
本方法适用于全部氨基酸的含量测定。7.2非水滴定法
7.2.1适用范围
本方法适用于能溶于乙酸（冰醋酸）的具有碱性的氨基酸样品的含量测定，不适用于氨基酸盐酸盐样品的含量测定。
7.2.2试剂
7.2.2.1高氯酸标准滴定溶液【c(HC1O)=0.1mol/L)按GB601之规定制备。
7.2.2.2结晶紫指示液的制备
称取0.20g结晶紫，溶于乙酸中，用乙酸（冰醋酸）稀释至100mL。7.2.3氨基酸含量测定
按产品标准的规定，称取一定量的试样，精确至0.0001g。置于干燥的锥形瓶中，加50mL乙酸溶解，加2滴结晶紫指示液（7.2.2.3)，用高氯酸标准滴定溶液（7.2.2.1)滴定至溶液呈蓝绿色。同时做空白试验。
含量按式(2)计算：
式中：W—氨基酸的含量，%
(Vi-V,)c. M× 100
V1——样品消耗高氯酸标准滴定溶液的体积，mLV2-
空白试验消耗高氯酸标准滴定溶液的体积，mL：一高氯酸标准滴定溶液的浓度，mol/L；C
M——与1.00mL高氯酸标准滴定溶液[c(HC10)=1.000mol/LJ相当的，以克表示的氨基酸的质量；
一试样的质量，g。
8灼烧残渣
按GB9741之规定测定。
展开剂
正丁醇+乙酸+乙醇（无水）+水
仲丁醇+甲酸(84%)+水
13648—92
附录A
常用氨基酸展开剂的组成和配比表(参考件）
配比(体积比)
4+1+1+2
15+3+2
正丁醇+甲基乙基丁酮十氨水十水仲丁醇+氨水(3%）
正丁醇+丙酮+二环已胺十水
正丁醇十丙酮十二乙胺十水
异丙醇+甲酸(84%)+水
苯+十吡啶+乙酸
A：吡啶+乙酸十水
B:乙酸乙酯+异丙醇
正丁醇+乙酸十水
中文名称
DL-丙氨酸
L-丙氨酸免费标准bzxz.net
DL-精氨酸
L-精氨酸
DL-天冬酰胺
L-天冬酰胺
L-天冬氨酸
L-瓜氨酸
L-半胱氨酸
DL-胱氨酸
L-胱氨酸
5+3+3+1
10+10+2+5
10+10+2+5
40+2+10
8+20+2
附录B
纸层析常用展开剂
纸层析分离苏氨酸和别苏氨酸的展开剂纸层析常用展开剂
纸层析分离碱性氨基酸常用展开剂薄层层析常用展开剂
薄层层析分离氨基酸衍生物常用展开剂常用氨基酸的比旋光度和熔点
（参考件）
英文名称(缩写)
DL-alanine(Ala)
L-alanine(Ala)
DL-arginine(Arg)
L-arginine(Arg)
DL-asparagine (Asp-NH)
L-asparagine (Asp-NH)
L-aspartic acid(Asp)
L-citrulline(Cit)
L-cystine(Cys)
DL-cystine(Cyss)
L-cystine(Cyss)
相对分子质量
熔点，cn)
213~215d
（水合物）
269~271
234~237d
258~261d
溶解度?
比旋光度”[a~25
[A]+25. 4
[A]-232
中文名称
DL-谷氨酸
L-谷氨酸
L-谷氨酰胺
甘氨酸
DL-组氨酸
L-组氨酸
L-羟脯氨酸
DL-异亮氨酸
L-异亮氨酸
DL-亮氨酸
L-亮氨酸
DL-赖氨酸
L-赖氨酸
DL-甲硫氨酸
（蛋氨酸）
L-甲硫氨酸
DL-苯丙氨酸
L-苯丙氨酸
DL-脯氨酸
L-脯氨酸
DL-丝氨酸
L-丝氨酸
DL-苏氨酸
L-苏氨酸
DL-色氨酸
L-色氨酸
DL-酪氨酸
L-酪氨酸
DL-氨酸
英文名称(缩写)
DL-glutamicacid(Glu)
L-glutamic acid(Glu)
L-glutamine(Glu-NH)
Glycine(Gly)
DL-histidine(His)
L-histidine(His)
L-hydroxyproline(Pro-oH)
DL-isoleucine(lle)
L-isoleucine(lle)
DL-leucine(Len)
L-leucine(Len)
DL-lysine(Lys)
L-lysine(Lys）
DL-methionine (Met)
L-methionine (Met)
DL-phcnylalanine(Phe)
L-phcnylalanine(Phe)
DL-proline(Pro)
L-proline(Pro)
DL-serine(Ser)
L-serine(Ser)
DL-threonine(Thr)
L-threonine(Thr)
DL-tryptophane(Trp)
Ltryptophant(Trp)
DL-tyrosine(Tyr)
L-tyrosine(Tyr)
DL-yaline(Val)
13648—92
续表B1
相对分子质量
131,17
熔点，℃1
225~227d
247~249d
184~185
285~286d
285~286d
318~320d
283~284d
220~222d
223~226d
235分解点
253分解点
283~285
281~282
溶解度”
比旋光度\[a0~25
[B]-76
［AJ+16.0
[B]-11. 0
［AJ+23.2
[B]-10. 0
［AJ-60.3
［AJ+15.1
［AJ-15.0
[A]-10. 0
中文名称
L-缬氨酸
英文名称（缩写）
L-valine(Val)
注：1)d代表达到熔点后分解。
GB13648—92
续表B1
相对分子质量
熔点，℃1)
2）在25℃于100g水中溶解的质量。特殊的温度条件则注明在右上角溶解度2
比旋光度”[a~2
［AJ+28.3
3)[A]加50~200mg试样于10mL15%盐酸中；[B]加50~200mg试样于10mL水中；[c]加951.9mg试样于10%盐酸中。
附录C
氨基酸的特殊显色剂
(参考件)
C1甘氨酸显色剂
c1.1试剂
试剂甲：称取0.20g邻苯二甲醛，溶于100mL丙酮中。试剂乙：称取1.0g氢氧化钾，溶于100mL95%乙醇中C1.2显色
把层析纸在试剂甲中浸拉后，于100℃干燥，再于试剂乙中浸拉，于100℃干燥10min。甘氨酸显绿色。
C2酪氨酸显色剂
C2.1试剂
试剂甲：称取0.10g1-亚硝基-2-萘酚，溶于100mL乙醇溶液（75%）中。试剂乙：量取15mL硝酸，稀释至100mL。C2.2显色
层析纸上先喷试剂甲，吹干后，再喷试剂乙，100℃保温3min。酪氨酸或含酪氨酸的多肽显红色，其底色为浅绿色，放置30min后斑点转为桔红色，其后渐褪去。C3组氨酸和酪氨酸的显色剂
C3.1试剂
试剂甲：称取4.50g对氨基苯磺酸，加45mL盐酸，加热溶解，稀释至500mL。在0℃将此溶液与等体积的亚硝酸钠溶液(50g/L)混合。试剂乙：碳酸钠溶液（100g/L）。C3.2显色
层析纸上先喷试剂甲，片刻后再喷试剂乙。组氨酸显桔红色，酪氨酸显红色。C4丝氨酸和羟脯氨酸的显色剂
c4.1试剂
试剂甲：称取6.75mg高碘酸钠，加甲醇溶解，加2滴盐酸溶液(20%)，用甲醇稀释至100mL。试剂Z：称取15.0g乙酸铵，加0.3mL乙酸（冰醋酸，加1mL乙酰内酮，用甲醇稀释至100mLC4.2显色
GB13648—92
层析纸上先喷试剂甲，近干后再喷试剂乙，室温放置2h。在紫外灯（波长：254～340nm）下照30min，丝氨酸和羟脯氨酸都显黄色，并都具有荧光。C5精氨酸显色剂
C5.1方法-
试剂甲：称取5.0g尿素，溶于100mLα-萘酚-乙醇溶液(0.1g/L）中。按每100mL溶液加3g氢氧化钾于使用前制备。
试剂乙：取0.7mL溴水，加100mL氢氧化钠溶液（50g/L），混。C5.2方法二
试剂甲：称取0.10g8-羟基喹啉，溶于100mL丙酮中。试剂乙：取1mL溴水，加500mL氢氧化钠溶液（20g/L），混勺。C5.3显色
方法一和方法二均先喷试剂甲，吹干后再喷试剂乙，精氨酸显红色斑点。C6脯氨酸
C6.1试剂
称取1.0g吲哚醒、1.50g乙酸锌，加1mL乙酸（冰醋酸）、5mL水及95mL异丙醇混合溶解。C6.2显色
层析纸上喷此显色剂后，在80~85℃保温30min。脯氨酸显蓝色，以30℃温水洗去多余的显色剂后，背景为白色或浅黄色。
色氨酸
C7.1试剂
称取1.0g对二甲氨基苯甲醛，溶于95mL95%乙醇中，加5mL盐酸，混勾。C7.2显色
层析纸上喷此显色剂后，吹干，色氨酸显紫色。附加说明：
本标准由中华人民共和国化学工业部提出。本标准由北京化学试剂总厂归口。本标准由中国科学院上海生物化学研究所东风生化技术公司负责起草。本标准主要起草人陆之贤。
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