【国家标准(GB)】 食品中葡萄糖的测定方法 酶-比色法和酶-电极法

GB/T16285-1996
食品中葡萄糖的测定方法，一般采用《国际食糖分析方法统一委员会》规定的“兰-埃农法”（LaneandEynon'smethod）和\姆松-华尔格法\（MunsonandWalker'smethod），即菲林氏溶液氧化还原滴定法。此法虽沿用已久，但测定结果只是近似值。因使用菲林氏溶液滴定葡萄糖（还源糖）时，其他具有还原能力的单糖会干扰测定结果。本标准采用的酶-比色法和酶-电极法是在检索了近20年107篇国外文献的基础上，经过反复实验、验证而制定的。酶-比色法和酶-电极法使用的葡萄糖氧化酶（GOD）具有专-性，只能催化葡葡糖水溶液中的β-D-葡萄糖起反应（被氧化)，因此测定结果是真实值。本标的酶比色法为仲裁法酶-电极法为快速法。本标准的附录A、附录B都是标准的附录。本标准由全国食品工业标准化技术委员会提出并旧口。本标准起草单位：中国农垦北方食品监测中心（酶-比色法）：山东省科学院生物研究所（酶-电极法）。
本标准经全国食品工业标准化技术委员会秘书处审核。本标准主要超草人：张宗城、刘宁、冯德菜、孙士青、宋家华、郝煜。327
中华人民共和国国家标准
食品中葡萄糖的测定方法
酶比色法和酶电极法
Method for determimnation of glucose in food.--Enzyme-colorimetric method and enzyme-el ectrode method1范围
本标准规定了用酶-比色法和酶-电极法测定食品中葡萄糖的方法。GB/T 16285--1996
本标准适用于各类食品中葡萄糖的测定：亦适用于食品中其他组分转化为萄糖的测定。本标准酶-比色法的最低检出限量为0.01ug（葡翻糖）/ml（试液）：酶-电极法的最低检出限量为1.0 mg/100 mL,
2酶-比色法
2.1原理
葡葡糖氧化酶（GOD)在有氧条件下，催化β-D-葡糖（葡葡糖水溶液状态）氧化，生成D-葡萄糖酸内酯和过氧化。受过氧化物酶（POD)催化，过氧化氢与4-氮基安替比林和苯酚生成红色醒亚胺。在波长505nm处测定醒亚胺的吸光度，计算食品中葡糖的含量C.Hi.O.+O. CODC,H:O:+H,O
H,O.+C.H,OH+Ch.H.N.O PODC.H,NO+HO2.2试剂
2.2.1组合试剂盒
1号瓶：内含0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH=7.0）100mL，其中4-氨基安替比林为0. 001 54 mol/L,
2号瓶：内含0.022mol/L苯酚溶液100mL3号瓶：内含葡萄糖氧化酶（glucoseoxidase）40oU（活力单位）、过氧化物酶（辣根，peroxidase）1000U（活力单位）。
1、2、3号瓶须在4℃左右保存。2.2.2酶试剂溶液：将1号瓶和2号瓶的物质充分混合均匀，再将3号瓶的物质溶解其中，轻轻播动（勿剧烈摇动），使葡萄糖氧化酶和过氧化物酶完全溶解。此溶液须在4左右保存，有效期1个月。2.2.30.085mol/L亚铁氰化钾溶液：称取3.7g亚铁氰化钾K,Fe（CN)。·3H.O,GB1273，分析纯，溶于100mL重蒸馏水中，摇匀。
2.2.40.25mol/L硫酸锌溶液：称取7.7g硫酸锌（ZnSO,·7H,0,GB666，分析纯），溶于100mL重蒸馏水中，摇匀。
2.2.50.1mol/L.氢氧化钠溶液：称取4g氢氧化钠（GB629，分析纯），溶于1000mL重蒸馏水中，摇匀。
2.2.6葡萄糖标准溶液：称取经100±2℃烘烤2h的葡萄糖（HG3-1094，分析纯）1.0000g，溶于重国家技术监督局1996-04-10批准328
1996-12-01实施
GB/T 162851996
蒸馏水中，定容至100mL，摇匀。将此溶液用重蒸馏水稀释V2.00—-→V100，即为200μg/mL葡萄糖标准溶液。
2.3仪器和设备
实验室常规仪器及下列各项：
2.3.1研钵或粉碎机。
2.3.2分析筛。
2.3.3组织捣碎机。
2.3.4恒温水浴锅。
2.3.5可见光分光光度计。
2.3.6微量移液管：1.00mL，精度0.01mL。2.4试样的制备
2.4.1固体样品
粉末状样品：取有代表性的样品至少200g，充分混匀，置于密闭的玻璃容器内。颗粒状样品：取有代表性的样品至少200g，用粉碎机粉碎，或用研钵研细，通过100目分析筛，置于密闭的玻璃容器内。
新鲜水果、蔬菜等固体样品：取有代表性的可食部分至少200g，用组织捣碎机捣碎，置于密闭的玻璃容器内。
2.4.2糊状样品
取有代表性的样品至少200g，充分混匀，置于密闭的玻璃容器内。2.4.3固液体样品
取有代表性的样品至少200g，用组织捣碎机捣碎，置于密闭的玻璃容器内。2.4.4液体样品
取有代表性的样品至少200mL，充分混匀，置于密闭的玻璃容器内。如样品中含二氧化碳，须用三角瓶取200mL，旋摇至基本无气泡，安装冷凝管，置沸水浴中加热10min，取出冷却至室温。2.5试液的制备免费标准下载网bzxz
2.5.1不含蛋白质的试样：用100mL烧杯称取试样（2.4)1~10g（精确至0.0001g），加少量重蒸馏水，转移到250mL容量瓶中，稀释至刻度。摇匀后用快速滤纸过滤。弃去最初滤液30mL，即为试液。试液中葡萄糖含量大于300μg/mL时，应适当增加定容体积。2.5.2含蛋白质的试样：用100mL烧杯称取试样（2.4)1～10g（精确至0.0001g），加少量重蒸馏水，转移到250mL容量瓶中，加入0.085mol/L亚铁氰化钾溶液（2.2.3）5mL、0.25mol/L.硫酸锌溶液（2.2.4)5ml和0.1mol/L氢氧化钠溶液（2.2.5）10mL，用重蒸馏水定容至刻度。摇匀后用快速滤纸过滤。弃去最初滤液30ml，即为试液。试液中葡萄糖含量大于300μg/mL时，应适当增加定容体积。2.6分析步骤
2.6.1标准曲线的绘制
用微量移液管取0.00,0.20,0.40,0.60,0.801.00mL葡萄糖标准溶液（2.2.6），分别置于10mL比色管中，各加入3ml.酶试剂溶液（2.2.2），摇匀，在36土1C水浴锅中恒温40min。冷却至室温，用重蒸馏水定容至10mL，摇匀。用1cm比色血，以葡萄糖标准溶液含量为0.00的试剂溶液调整分光光度计的零点，在波长505nm处，测定各比色管中溶液的吸光度。以葡萄糖含量为纵坐标，吸光度为横坐标，绘制标准曲线。2.6.2试液吸光度的测定
用微量移液管取0.50~~5.00mL试液（2.5）（依试液中葡萄糖的含量而定），置于10mL比色管中。以下按2.6.1步骤操作，但须用等量试液（2.5)调整分光光度计的零点。329
GB/T16285.---1996
测出试液吸光度后，在标准曲线上查出对应的葡葡糖含量。2.7分析结果的表述
样品中葡药糖的含量以质量百分率表示，按式（1）计算：X
1 000 ×1 000 × 100
X10000
式中，X，一一样品中葡萄糖的含量，质量百分率，%，C标准曲线上查出的试液中葡萄糖含量，ug，m.试样的质量.g
V,-—试液的定容体积,mL,
V--测定时吸取试液的体积，mL。计算结果精确至小数点后第二位。2.8允许差
同-样品的两次测定值之差，不得超过两次测定平均值的5.0%。3酶-电极法
3.1原理
葡萄糖氧化酶（GOD)在有氧条件下催化3-D-葡药糖（葡萄糖水溶液状态）氧化，生成D-葡药糖酸--内酯和过氧化。过氧化氢与过氧化氢型电极接触产生电流。该电流值与βD-葡萄糖的浓度呈线性比例，在酶电极葡葡糖分析仪上直接示葡药糖含量。CH,O +O, CODC.H.O+H,O2
3.2试剂
3.2.1组合试剂盒
理，葡萄糖氧化酶酶膜圈：含葡葡糖氧化酶（GOD）15U活力单位）：须在0-4C左右保存，有效期12个月。
b。复合试剂：含磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、乙二胺四乙酸二钠、氯化钠、苯甲酸钠、庆大霖素硫酸盐；常温保存，有效期24个月。βD-葡药糖标准溶液：浓度100.0mg/100mL，密封保存，有效期12个月。c.
3.2.2缓冲溶液
将袋复合试剂(3.2.1b)溶解在1000 mL蒸馏水中，摇匀。pH=7.2±0.1。3.3仪器和设备
实验室常规仪器及下列各项：
3.3.1研钵或粉碎机。
3.3.2分析筛。
3.3.3组织捣碎机。
3.3.4酶电极葡葡糖分析仪：直接读数式，测量范围0~100.0mg/100mL（β-D-葡萄糖）；测量精度±1.0 mg/100 ml(β-D-葡萄糖)。3.3.5微量进样器：容量50μL，精度1μL330
3.4试样的制备
3.4.1固体样品
GB/T 16285--1996
粉末状样品：取有代表性的样品至少200g，充分混匀，置于密闭的玻璃容器内。颗粒状样品：取有代表性的样品至少200g，用粉碎机粉碎，或用研钵研细，通过100目分析筛，置于密闭的玻璃容器内。
新鲜水果、蔬菜等固体样品：取有代表性的可食部分至少200名，置于密闭的玻璃容器内3.4.2糊状样品
取有代表性的样品至少200g，充分混勾，置于密闭的玻璃容器内。3.4.3固液体样品
取有代表性的样品至少200g，用组织捣碎机捣碎，置于密闭的玻璃容器内。3.4.4液体样品
取有代表性的样品至少200mL，充分混匀，置于密闭的玻璃容器内。如样品中含有二氧化碳，须用三角瓶取200mL，摇至基本无气泡，安装冷凝管，置沸水浴中加热10min，取出冷却至室温。3.5试液的制备
3.5.1固体试样和固液体试样
般固体试样和固液体试样：称取试样（3.4)1~10g（使之定容后葡萄糖含量为1~200mg/mL）于100ml.烧杯内，精确至0.0001g，用蒸馏水移入100mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，放置30min（摇动2～3次）。用快速滤纸或脱脂棉过滤。弃去最初滤液，收集1～2mL滤液于带盖小试管中。水果、蔬菜试样：称取试样（3.4）1～10g于100mL烧杯内（使之定容后葡葡糖含量为1~200mg/mL），精确至0.0001g。加入煮沸的蒸馏水30~50mL和5mL缓冲溶液（3.2.2），继续煮沸3～5min，冷却至室温后用研钵研细或用组织捣碎机捣碎。用蒸馏水移入100mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀。用快速滤纸或脱脂棉过滤。弃去最初滤液，收集1～2mL滤液于带盖小试管中。食用葡萄糖试样：称取试样（3.4)1～10g于100mL烧杯内，精确至0.0001g。加入约50mL蒸馏水，溶解后煮沸2min。冷却后用蒸馏水移入1000mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀。3.5.2糊状和液体试样
称取试样（3.4）1~10g（使定容后葡萄糖含量为1～200mg/mL）于100mL烧杯内，精确至0.0001g。用蒸馏水移入100mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀。用快速滤纸或脱脂棉过滤（如溶液呈透明状，可免除过滤）。弃去最初滤液，收集1～2ml.滤液于带盖小试管中。3.6分析步骤
3.6.1校正仪器
从组合试剂盒中取出电极，将其表面清理干净，吸取缓冲溶液（3.2.2)滴在电极表面。用小镊子取一片酶膜圈，安装在电极表面，使酶膜圈中心和电极中心的白金完全贴紧，形成无气泡的薄层液体，然后将电极安装在反应池内。
仪器开机后，缓冲溶液即自动进入反应池，并自行冲洗。当仪器出现进样指令后，用微量进样器准确吸取25μL标准溶液（3.2.1c），用滤纸擦净针尖外部，将标准溶液注入进样口内。20～40s后仪器自动显示标准溶液的指示值。再等30~60s，仪器自行完成冲洗过程，即可重复注入标准溶液（3.2.1c）数次，直至仪器显示允许开始测定样品。当连续两次标准溶液显示值的相对误差小于2.0%时，即完成校正步骤。
3.6.2测定样品
用试液（3.5）冲洗微量进样器，至少两次。准确吸取25αL试液（3.5），用滤纸擦干针尖外部，注入进样口。20～40s后读取显示值。
3.7分析结果的表述
样品中葡葡糖的含量以质量白分率表示，按式（2)计算：331
GB/T 16285--1996
1000×ml×100
式中：X样品中葡萄糖的合含量，质量百分率，%R-仪器测定值，mg/100mL
V试液的定容体积，mL，
试样的质量，g。
计算结果精确至小数点后第1位。3.8允许差
同一样品的两次测定值之差：
1000×m
样品中葡萄糖盒量小于1.0%时，不得超过两次测定平均值的5.0%中★中的（ 2)
样品中葡萄糖含量大于或等于1.0%时，不得超过两次测定平均值的2.0%。332
A1技术要求
A1.1酶活力　
GB/T 16285--1996
附录A
（标准的附录）
葡药糖氧化酶、过氧化物酶的技术要求、试验方法及判定规则葡萄糖氧化酶酶活力（U/mg）：≥20;过氧化物酶酶活力(U/mg)：≥50。A1.2干扰酶
葡萄糖氧化酶、过氧化物酶中都不得含有纤维素酶、淀粉葡萄糖苷酶、β-果糖苷酶、半乳糖苷酶和过氧化氢酶。
A2试验方法
用移液管吸取0.50mL葡糖标准溶液（2.2.6）置于10mL比色管中，加入100μg可溶性淀粉（HGB3095，分析纯）、100μg纤维二糖（生化试剂）、100ug乳糖（HG3-1000，分析纯）和100μg蔗糖HG3-1001，分析纯）,再加入3mL试剂溶液（2.2.2）。以下按2.6.1步骤操作。测定吸光度后，在标准曲线（按2.6.1)上查出对应的葡萄糖含量，按式（A1)计算葡萄糖的回收率：F
式中：F—葡萄糖的回收率，%；C—葡萄糖的实测值，μg。
A3判定规则
0. 5×200×100
（Al）
测得葡萄糖的回收率，如在95%～105%范围内，则判定葡萄糖氧化酶和过氧化物酶符合要求。附录B
（标准的附录）
葡萄糖氧化酶酶膜围性能判定方法B1 酶膜活性的判定
校正仪器时，注入25μL标准溶液（3.2.1c），仪器显示标准溶液的指示值后，按下酶膜响应键，则显示出酶膜活性相对值。如相对值大于10.0，则表示酶膜活性符合要求；相对值小于10.0时.应更换新酶膜。
B2酶膜线性的判定
校正仪器操作步骤完成后，仪器显示酶膜线性检查指令。用微量进样器注入50μL标准溶液（3.2.1c），如显示值大于184.0，表示酶膜线性良好；小于184.0时，应按下仪器线性校正键，进行线性333
校正，或更换新酶膜。
B3酶膜抗干扰性的判定
GB/T16285—1996
校正仪器操作步骤完成后，用微量进样器吸取25L新配制的1%亚铁氰化钾溶液，注入反应池进样口。当仪器显示值为-2.0～十6.0时，表示酶膜抗干扰符合要求；否则应更换新酶膜。1%亚铁化钾溶液的配制：用100mL烧杯准确称取1.15g亚铁氰化钾[K,Fe（CN)。·3H20,GB1273，分析纯]，加入少量蒸馏水使之溶解，转移至100mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀。334
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