【国家标准(GB)】 婴幼儿配方食品和乳粉 肌醇的测定

GB/T5413.25—1997
本标准等同采用美国公职分析化学师协会（AOAC）方法，测定的是具有生物效价的肌醇含量本系列标准从实施之日起，代替GB5413—85。本标准由中国轻工总会提出。
本标准由全国乳品标准化中心归口。本标准负责起草单位：国家乳制品质量监督检验中心。本标准参加起草单位：卫生部食品卫生监督检验所、浙江省轻工业研究所、哈尔滨森永乳品有限公司、省巢（中国）投资服务有限公司。本标准主要起草人：张玉杰、王芸、房玉国、王克新。322
中华人民共和国国家标准
婴幼儿配方食品和乳粉
肌醇的测定
Milk powder and formula foods for infant and young children--Determination of inositol
1范图
本标准规定了肌醇的测定方法。GB/T5413.25—1997
代替GB5413-85
本标准方法一适用于婴幼儿配方食品和乳粉中肌醇的测定，方法二适于乳粉中肌醇的测定。方法一微生物法www.bzxz.net
2方法原理
通过Saccharomyces uvarum的生长情况来评价肌醇的含量。3试剂、菌种和培养基
所有试剂，如未注明规格，均指分析纯，所有实验用水，如未注明其他要求，均指三级水。3.1盐酸：体积比为1：1
将体积分数为37%的浓盐酸50mL用水稀释至100mL。3.2氢氧化钠：c(NaOH)为 1mol/L将40g氢氧化钠溶解于水中，稀释至1000mL。3.3肌醇标样：无水晶体。
3.4菌种
Saccharomyces uvarum.
3.5培养基
3.5.1链孢霉菌琼脂培养基：3号蛋白陈5g，酵母浸膏5g，麦芽糖40g，琼脂15g。3.5.2肌醇测定用培养基：葡葡糖100g，柠檬酸钾10g，柠檬酸2g，磷酸二氢钾1.1g，氯化钾0.85g，硫酸镁0.25g，氯化钙0.25g，硫酸锰50mg，氟化亚铁50mg，DL-色氨酸80mg，L-胱氨酸0.1g，L-异亮氨酸0.5g,L-赖氨酸0. 5g,L-蛋氨酸0.2g,DL-苯基丙氨酸 0.2g,L-酪氨酸 0.2g,L-天门冬酰胺 0.8g,DL-天门冬氨酸 0. 2g,DL-丝氨酸 0.1g，甘氨酸 0. 2g,DL-苏氨酸 0. 4g,L-缬氨酸 0.5g,L-组氨酸 0.124g,L-脯氨酸0.2g,DL-丙氨酸0.4g,L-谷氨酸0.6g，L-精氮酸0.48g，盐酸硫胺素500pg，生物素16μg，泛酸钙5mg，盐酸吡哆醇1mg，加蒸馏水至1000mL，pH5.2±0.2（25℃）。4仪器
常用实验室仪器及：
4.1 pH计。
国豪技术监督局1997-05-28批准1998-09-01实施
GB/T5413.25-1997
4.2250mL圆底烧瓶，与冷凝器连接的锥形鼓璃接头。4.3比色仪。
5样品制备
5.1贮备菌种的制备
5.1.1从纯菌种S.uvarum中转接2个以上已制备好的麦芽浸出汁琼脂斜面。30℃培养16～24h。贮于冰箱中，保存期不要超过2周，然后再转接到新的琼脂斜面上。5.1.2接种的准备
最好在使用的当天从贮备菌种中转接到新配制的麦芽浸出汁琼脂斜面上，30℃培养16～24h。用接种环无菌地转接该菌种到一个灭菌生理盐水中，直到得到一定浓度菌体细胞的悬浮液。为了测定，制备一个酵母菌恶浮水溶液，这个悬浮液中酵母菌的浓度在0.1mg/mL。分光光度计事先用水调到100%透光率，然后测定这个“标准”酵母菌的透光率。将新接种斜面中的菌体细胞移入到无菌生理盐水中，其浓度直到达到与上述标准溶液具有相同的透光率为止。5.2标准溶液
5.2.1标准贮备液，肌醇的浓度为0.2mg/mL。箱。
称取100mg肌醇（该肌醇标样已放在干燥器中干燥24h），于容量瓶中用水稀释至500mL。贮于冰5.2.2标准工作液，肌醇的浓度为2ug/mL。吸取5mL（5.2.1)溶液，用水稀至500mL，定容。当天制备。6操作步骤
6.1样品的处理
6.1.1干粉样品
精确称取定量样品，这些样品中约含肌醇0.5mg，移入250mL圆底烧瓶中，加100mL盐酸（1：1）(3.1)，继续6.1.3步骤。
6.1.2液体样品。
吸一定量样品，这些样品中约含肌醇0.5mg，加100mL盐酸（3.1），继续6.1.3步骤。6.1.3将装样品的圆底烧杯与冷凝器联结，经过6h，通过蒸馏将盐酸除去。将剩余物用蒸馏水冲到烧杯中，用1mol/L氢氧化钠将溶液的pH值调至5.1土0.1。稀释至250mL，过滤，弃去前部几毫升。这个溶液肌醇的浓度均为2μg/mL。6.2标准曲线
按表1顺序加入蒸馏水、标准溶液于培养管中，一式三份。表1
试管号No
蒸馏水，ml
标准溶液,mL
6.3测定液
按表2顺序加入蒸馏水、样品溶液于培养管中，一式三份。表2
试管号 No.
蒸馏水，mL
样品溶液，mL
6.4热处理
GB/T 5413.25—1997
用棉塞或不锈钢帽盖住所有试管，100℃蒸汽蒸10min。6.5接种
：冷却试管至30℃以下。无菌添加接种物于基础贮备培养基中，以每100mL添加2mL的比例添加，充分混合，将上述已接种的培养基无菌加入到6.2和6.3的每个测定管中，每管加5mL（其中标准曲线中 No.1号试管只加 5mL未接种的培养基)。6.6培养
将试管固定在机械振荡器上，以每分钟振荡100～200次的往复运动中，28～30℃之间选择个恒定温度（士0.5℃）培养22~24h。6.7测定
从振荡器上取下试管，于100℃蒸5min或每管加1滴杀菌剂（Thoral)，以使其停止生长。试管被任何外来微生物污染则测定无效。通过对每个试管的视觉检查进行反应的预测，未接种管是清的，标准溶液和样品中应无其他微生物生长。充分混合每一个试管（也可以加一滴消泡剂），将反应液加到比色血内，搅拌内容物，将比色血放入到分光光度计的比色池内，波长为540～660nm，读出透光率或吸光度，稳定30s，每个试管稳定时间要相同。
对于未接种管，将其透光率调到100%（或吸光度为0），读出其他接种空白管的读数。将接种空白管的透光率调到100%（或吸光度为0），依次读出其他每个管。对每个水平的测试溶液，计算每毫升中维生素的含量，计算所得值的平均数，每个管测得值不得超过该平均值的土15%。如果所得到的管数，少于所测定的四种水平的稀释液的管数的2/3，用于计算样品浓度的数据是不充分的。如果剩余管数是原来管数的2/3或更多，则可根据平均值计算其样品的含量。
注：不可使用金属帽（除了不锈钢盖），这是由于试管在培养振荡过程中有金属污染的可能性。7分析结果的衰述
样品中肌醇的含量（mg/100g或mg/100mL）=式中：X测定管中每毫升测试溶液中肌醇含量的平均值，ug；一样品的质量或体积，g或ml。
8允许差
同一样品两次测定值之差不得超过两次测定平均值的10%。方法二气相色谱法
9方法提要
样品中的肌醇与衍生剂反应后，经气相色谱时行分离定量。10试剂
10.1 N-三甲基硅基咪唑。
10.2三甲基氮硅烷。
11仪器
11.1气相色谱仪：FID检测器。
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GB/T 5413.25—1997
11.2色谱柱：50%Phenylmethylcloxane,Db-17(J&w)。0.32mmidX30m0.25μm，12操作步骤
12.1准确称取1g样品于烧杯中，用温水溶解，转至100mL容量瓶中，定容。取5.0mL该溶液放入小试管中作为测定液。
12.2准确称取50mg肌醇标样于小烧杯中，用水溶解，转至100mL容量瓶中，定容。用吸量管取该溶液5mL于一100mL容量瓶中，用水定容。取此溶液2mL于小试管中。12.3将上述分别含有样品和标准溶液的试管冷冻干燥。于每个试管中加1mL内标溶液（每毫升吡啶中含0.05mg的蒽），盖紧塞子，放置15min。于每个试管中加0.5mL的N-三甲基硅基咪唑和0.2mol/L的，混合，静置15min后进样。12.4气相色谱条件：
a）柱温：140~260℃(5℃/min）b）检测器;FID,
c）检测器温度：280℃，
d）进样器:split(1:40)，
e）进样器温度：280℃，
f）进样体积：luL;
g）流速：1.4mL/min。
13分析结巢的衰述
样品中肌醇含量（mg/100g）
标准工作液浓度，μg/mL，
式中：c—
A.样品蜂面积，
一标样峰面积，
样品内标蜂面积，
标样内标蜂面积；
-样品的质量，g。
14允许差
同一样品两次测定值之差不得超过两次测定平均值的5%。326
200×cX200
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