【农业标准】 禽流感病毒RT-PCR试验方法

NY

ICS 11.220
B 41

中华人民共和国农业行业标准

NY/T 772—2004

禽流感病毒 RT-PCR 试验方法

2004-02-17 发布2004-02-17 实施

前 言

本标准由中华人民共和国农业部提出。

本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。

本标准推荐了两种试验方法。

本标准中附录 A、附录 C 为规范性附录，附录 B、附录 D 为资料性附录。

本标准起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、农业部兽医诊断中心。

本标准主要起草人：王秀荣、孙明、刘明、王宏伟、陈化兰、刘丽玲。

禽流感病毒 RT-PCR 试验方法(一)

1 范围

本标准规定了禽流感病毒型特异性检测技术和禽流感病毒 H5、H7、H9 血凝素亚型及 N1、N2 神经氨酸酶亚型的 RT-PCR 鉴别技术。

本标准适用于检测禽组织、分泌物、排泄物和鸡胚尿囊液中禽流感病毒核酸。

2 规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

GB/T 18936 高致病性禽流感诊断技术

3 实验室条件

3.1 仪器：PCR仪、台式低温高速离心机、电泳仪、电泳槽、冰箱、手提紫外线灯、紫外凝胶成像仪、微量移液器、水浴箱等。

3.2 从事 RT-PCR 工作的实验室尽可能分区，根据条件划分出 RNA 提取区、基因扩增区、电泳区。特别注意电泳后的琼脂糖凝胶要及时处理，避免对实验室造成污染。

3.3 注意个人防护和环境保护，电泳中用到的 EB 可诱发基因突变，试验中被 EB 污染的物品要有专用收集处，并通过焚烧进行无害化处理。

4 试剂的准备

4.1 试剂

4.1.1 变性液见 A.1。

4.1.2 2 M 醋酸钠溶液(pH 4.0)见 A.2。

4.1.3 水饱和酚(pH 4.0)。

4.1.4 氯仿/异戊醇混合液见 A.3。

4.1.5 M-MLV 反转录酶(200 u/μL)。

4.1.6 RNA 酶抑制剂(40 u/μL)。

4.1.7 Taq DNA 聚合酶(5 u/μL)。

4.1.8 1.0% 琼脂糖凝胶见 A.4。

4.1.9 50×TAE 缓冲液见 A.5。

4.1.10 溴化乙锭(10 μg/μL)见 A.6。

4.1.11 加样缓冲液见 A.7。

4.1.12 焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的灭菌双蒸水见 A.8。

4.1.13 5×反转录反应缓冲液见 A.9。

4.1.14 2.5 mmol dNTPs 见 A.10。

4.1.15 10×PCR Buffer 见 A.11。