【商检行业标准(SN)】 猪流行性腹泻微量血清中和试验操作规程

SN

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准

SN/T 1699.1-2006

猪流行性腹泻微量血清中和
试验操作规程

Protocol of micro-serum neutralization test for porcine epidemic diarrhea

前 言

SN/T 1699 分为三部分：

• 猪流行性腹泻微量血清中和试验操作规程；
• 猪流行性腹泻病毒间接免疫荧光试验操作规程；
• 猪流行性腹泻间接血点酶联免疫吸附试验操作规程。

本部分为 SN/T 1699 的第 1 部分。

本部分参照国际动物卫生组织（OIE）的标准《诊断方法和疫苗标准手册》，2004年第五版，并参考中华人民共和国进出境动植物检疫规程手总制定。

本部分的附录 A 为规范性附录。

本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。

本部分起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局。

本部分起草人：罗长保、林志雄、朱道中、黎思通。

本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。

猪流行性腹泻微量血清中和
试验操作规程

1 范围

SN/T 1699的本部分规定了猪流行性腹泻微量血清中和试验操作技术要求。

本部分适用于猪流行性腹泻微量血清中和抗体检测。

2 规范性引用文件

下列文件中的条款通过 SN/T 1699 的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分。然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。

GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法

3 设备和材料

3. 猪流行性腹泻病毒株：已适应于传代细胞生长的猪流行性腹泻病毒 PEDV G1 毒株。
4. 猪流行性腹泻阴性对照血清。
5. 猪流行性腹泻阳性对照血清。
6. 细胞：PK-15 传代细胞。
7. 96孔微量细胞培养板。
8. 微量移液器。
9. 被检血清。
10. 细胞培养基（Eagle's MEM）。
11. 本标准所用水应符合 GB/T 6682 中二级水的规格。

4 操作方法

4. 病毒增殖
   在 PK-15 细胞形成单层后倒掉培养液，将病毒母液接种到单层细胞上。摇匀后置 37℃、5%二氧化碳培养箱吸附 1 h。吸附期间搅匀一次，然后加入含 5% 小牛血清细胞培养基（Eagle's MEM）。每天观察细胞病变 (CPE)，CPE 达到 75%～95%时收获。反复冻融三次后分装，置 -70℃保存，待测定毒价后使用。
5. 毒价测定
   在 96 孔微量板每孔加入 50 μL 培养液，将上述病毒母液用培养液按 10 倍递减法在另外的容器内稀释成 $10^{-1}$～$10^{-8}$个稀释度。用移液器将每一稀释度的病毒液分别移入 8 个孔内，每孔 50 μL。将培养好的 PK-15 细胞制备成 $20 \times 10^4 / mL$ ～ $30 \times 10^4 /mL$ 的悬液，在每个试验孔内加 100 μL，每孔总量为 200 μL。另设不加病毒液的 8 个细胞孔作为对照，用 50 μL 培养液代替病毒液。置 37℃、5%二氧化碳培养箱中培养 72 h，每天观察 CPE，72 h 判定结果。
   毒价测定：用 Kerber 方法测定 50%细胞病变浓度 (TCID$_{50}$)，见附录 A。
6. 血清处理
   置 56℃水浴箱内灭活 30 min。