【其他行业标准】 贝类 脂溶性海洋生物毒素的检测 液相色谱—串联质谱法

ICS07.060;13.020
CCSZ19
中华人民共和国海洋行业标准
HY/T0319—2021
脂溶性海洋生物毒素的检测
液相色谱-串联质谱法
Shellfish-Determination of lipophilic marine biotoxins-LC-MS/MSmethod
2021-07-02发布
中华人民共和国自然资源部
2021-11-01实施
HY/T0319—2021
规范性引用文件
试剂和材料
仪器设备
试验步骤
结果计算与表述
精密度
10其他·
附录A（资料性）
附录B（资料性）
附录C（规范性）
参考文献
脂溶性海洋生物毒素
特征离子质量色谱图
脂溶性海洋生物毒素的毒性因子次
HY/T0319—2021
本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
本文件由中华人民共和国自然资源部提出。本文件由全国海洋标准化技术委员会（SAC/TC283)归口。本文件起草单位：国家海洋环境监测中心、中国科学院海洋研究所、厦门大学、中国水产科学研究院黄海研究所。
本文件主要起草人：许道艳、梁玉波、刘仁沿、刘磊、陈猛、于仁诚、潭志军、高春蕾、续彦龙。I
脂溶性海洋生物毒素的检测
液相色谱-串联质谱法
HY/T0319—2021
警示一一为避免毒素的危害，应戴手套进行操作。移液管及移液器吸头等用过的器材、废弃的提取液等应在次氯酸钠溶液(5%）)浸泡1h以上以使毒素分解。1范围
本文件规定了贝类脂溶性海洋生物毒素大田软海绵酸、鳍藻毒素、蛤毒素、虾夷扇贝毒素、原多甲藻酸毒素、环亚胺毒素等11个毒素化合物的液相色谱-串联质谱检测方法原理、操作步骤及结果计算等。本文件适用于贝类体中脂溶性海洋生物毒素的检测。2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法。3原理
贝类样品经甲醇提取，碱性条件下水解释放酯化态生物毒素部分，用HLB固相萃取柱净化，液相色谱分离，串联质谱测定，外标曲线法定量。4试剂和材料
乙腈(CHCN)：色谱纯。
甲醇(CH,OH)：色谱纯。
甲酸（HCOOH)。
甲酸铵（HCOONH4）。
氨水（NH3·HzO)：浓度≥25%。4.6
氢氧化钠（NaOH)。
盐酸（HCL）：浓度≥36%。
氢氧化钠溶液（2.5mol/L）：准确称取50g氢氧化钠，用水定容至500mL，室温保存。盐酸溶液（2.5mol/L）：准确量取104.5mL盐酸，用水定容至500mL，室温保存。4.10
甲醇溶液（30%）：量取30mL甲醇加到70mL水中，混合均匀，室温，现用现配。4.11甲醇溶液（20%）：量取20mL甲醇加到80mL水中，混合均匀，室温，现用现配。4.12
氨水甲醇溶液（0.3%）：吸取0.3mL氨水，用甲醇定容至100mL，室温，现用现配。4.13脂溶性海洋生物毒素标准（见附录A）溶液：OA、DTX1、DTX2、PTX2、YTX、homoYTX、AZA1、AZA2、AZA3、GYM、SPX1标准物质纯度≥97%，避光保存于一20℃C。1
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4.14脂溶性海洋生物毒素标准储备液：分别吸取适量的各脂溶性海洋生物毒素标准溶液（见4.13），甲醇（见4.2)配制储备溶液。0.22μm滤膜（见5.12）过滤，一20℃避光保存备用。各脂溶性海洋生物毒素标准储备液浓度分别为：OA40ng/mL，DTX140ng/mL，DTX240ng/mL，YTX400ng/mL，ho-moYTX400ng/mL，PTX21000ng/mL,SPX1200ng/mLGYM10ng/mL，AZA1200ng/mL,AZA2100ng/mL，AZA3100ng/mL。4.15脂溶性海洋生物毒素混合标准工作溶液：分别吸取适量的各脂溶海洋生物毒素标准储备溶液（见4.13），甲醇（见4.2)配制正离子混合标准工作溶液（PTX2、AZA1、AZA2、AZA3、GYM、SPX1)和负离子混合标准工作溶液（OA、DTX1、DTX2、YTX、homoYTX）。0.22μm滤膜（见5.12）过滤，一20℃避光保存备用。各脂溶性海洋生物毒素的浓度见表1。注：除非另有说明，以上所用试剂均为分析纯试剂，水为符合GB/T6682规定的一级水。表1脂溶性海洋生物毒素标准工作溶液浓度单位为纳克每亳升
正离子
负离子
仪器设备
毒素简称
homoYTX
浓度1
浓度2
液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）。分析天平：感量0.00001g。
天平：感量0.01g。
匀质机。
涡漩振荡器。
离心机。
水浴锅。
固相萃取装置。
真空泵。
pH计。
浓度3
浓度4
浓度5
1固相萃取柱：基质为含有N-乙烯吡咯烷酮聚合物的吸附剂，填料质量为30mg，体积为1mL，或5.11
者相当。
20.22μm滤膜。
6样品
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用清水将贝类外表清洗干净。切开闭壳肌打开贝壳，用蒸馏水淋洗贝类内部以清除泥沙和其他杂物，取出贝肉置于孔径约2mm的金属筛网上沥水5min。为保证样品的均匀性，至少取100g贝肉用匀质机匀浆30min，充分混匀。
7试验步骤
7.1提取
称取2.00g贝类组织匀浆于具塞离心管中。加人9.0mL甲醇（见4.2)，用涡旋振荡器混匀1min，3000rpm离心10min，上清液转移至20mL的容量瓶中，沉渣再加入9mL甲醇（见4.2)重复提取一次，合并两次提取液，用甲醇（见4.2)定容至20mL，将溶液分成两份，备用。7.2水解
为了检测酯化态的OA组毒素含量。取1.0mL(7.1中的一份）放人色谱进样瓶中，加入125μL氢氧化钠溶液（见4.7），用涡旋振荡器混匀0.5min，置于76℃水浴40min，冷却至室温，加人125μL盐酸溶液（见4.8)中和，涡旋混匀0.5min，0.22μm滤膜过滤后备用。7.3净化
固相萃取柱依次用1.0mL甲醇活化、1.0mL30%甲醇平衡。取1.0mL提取液（7.1中的另一份）加2.8mL水混匀后转入预处理的固相萃取柱，以约每秒一滴的流速通过固相萃取柱，用1.0mL20%甲醇溶液淋洗，再以1.0mL氨水甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，摇匀后，0.22μm滤膜过滤，液相色谱-串联质谱测定。按照7.3步骤净化水解液（见7.2）。7.4样品测定
7.4.1正离子模式液相色谱参考条件正离子模式测定PTX2、AZA1、AZA2、AZA3、GYM、SPX1，液相色谱参考条件如下。a）色谱柱：C18，50mm×2.1mm，填料粒径2.5μm，或相当者。流动相：A：2mmol/L甲酸铵和50mmol/L甲酸的水溶液；B:2mmol/L甲酸铵和50mmol/L甲b
酸的95%乙腈水溶液。
流速：0.3mL/min。
柱温：25℃。
进样量：10μL。
流动相梯度：0min~4min，10%B线性变化至80%B；4min~6min，保持80%B，6min~f
6.5min线性变化至10%B，平衡2.5min。7.4.2负离子模式液相色谱参考条件负离子模式测定OA、DTX1、DTX2和YTX、homoYTX，液相色谱参考条件如下：色谱柱：C18，150mm×3.0mm，填料粒径3.5μm，或相当者。a)包
流动相：A：0.05%的氨水溶液（pH11)；B：含有0.05%氨水的乙腈-水（90/10，体积比）溶液b）
(pH11)。
流速：0.4mL/min。
柱温：40℃。
e）进样量：10μL。
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流动相梯度：1min~10min，10%B线性变化至90%B；10min~13min，保持90%B，13min~15min线性变化至10%B，平衡4min。7.4.3质谱条件
质谱条件如下：
离子源：电喷雾离子源。
扫描模式：正离子和负离子模式。检测方式：多反应监测。
喷雾电压：4500V。
毛细管温度：450℃（正离子模式）；600℃（负离子模式）。源内碰撞解离电压：5V。
雾化气流速：60L/min。
辅助加热气流速：50L/min。
离子碎片参数见表2。
目标毒素
homoYTX
母离子m/z
离子对、锥孔电压和碰撞电压
子离子m/z
锥孔电压
碰撞电压
7.4.4标准曲线制作下载标准就来标准下载网
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毒素标准系列工作液（见4.13)分别注人液相色谱-串联质谱仪中，测定相应各毒素的峰面积，以标准工作液的质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。7.4.5试样溶液测定
将试样溶液注入液相色谱-串联质谱仪中，得到峰面积，根据基质标准曲线得到试样溶液中各毒素的质量浓度。在上述检测条件下，试样溶液中各毒素的保留时间与标准溶液中毒素的保留时间之间的偏差应在士2.5%之内。试样溶液与标准工作液中毒素的定性离子的相对丰度一致，其丰度比偏差应符合表3要求。各毒素的特征离子质量色谱图见附录B。表3定性测定相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度
允许的相对偏差
空白试验
>20%~50%
>10%~20%
除不加试样外，按（7.1、7.2、7.3)步骤得到空白溶液，测定方法同（7.4)。8结果计算与表述
8.1结果计算
样品中各脂溶性海洋生物毒素的含量按公式(1)计算。X, =(c, -co) ×
式中：
X，-试样中脂溶性海洋生物毒素的含量，单位为微克每千克（ug/kg)；10%
.（1）
从标准工作曲线中得到的试样中脂溶性海洋生物毒素溶液浓度，单位为纳克每毫升Ci
(ng/mL);
c。—从标准工作曲线中得到的空白试验中脂溶性海洋生物毒素溶液浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL);
样品溶液最终定容体积，单位为毫升（mL）；最终样品溶液所代表试样质量，单位为克（g）。以重复性条件下平行测定结果的算术平均值表示，保留三位有效数。8.2总毒力计算
脂溶性海洋生物毒素的毒性因子列于附录C。样品中脂溶性海洋生物毒素的含量则按照毒性因子，统一转换为Wneq来表示，计算公式（2)：Wneg
Wneg—表示各毒素（OAs、PTXs、AZAs、YTXs)的总毒力；X，一—表示相对应的脂溶性海洋生物毒素的含量，单位为微克每千克（μg/kg)；r：毒性因子。
（2）
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精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。本方法的批内相对标准偏差≤15%，实验室间相对标准偏差≤37%。10
本方法各毒素的定量限示于表4中。本方法在0.08μg/kg～200μg/kg添加浓度水平上的回收率为80%~120%。
目标毒素
homoYTX
脂溶性海洋生物毒素定量限
定量限
μg/kg
(资料性）
脂溶性海洋生物毒素
脂溶性海洋生物毒素标准名称及相关信息见表A.1。脂溶性海洋生物毒素标准名称及相关信息表A.1
毒素简称
homoYTX
中文名称
大田软海绵酸
鳍藻毒素-1
鳍藻毒素-2
扇贝毒素-2
虾夷扇贝毒素
类虾夷扇贝毒素
原多甲藻酸-1
原多甲藻酸-2
原多甲藻酸-3
环亚胺毒素
13-去甲螺旋内酯C
英文名称
Okadaic acid
Dinophysistoxin-1
Dinophysistoxin-2
Pectenotoxin-2
Yessotoxin
homoyessotoxin
Azaspiracid-1
Azaspiracid-2
Azaspiracid-3
Gymnodimine
13-Desmethyl-spirolideC
分子式
CuHaOrs
Cas Ho O13
CuHsa O13
CaH%Ou
CsHe O2iS2
CseHgO2S2
CanHnNO12
ChsHraNO12
Cas HaNO12
Ca2HasNO.
Ca2HaNO,
分子质量
HY/T0319-—2021
78111-17-8
81720-10-7
139933-46-3
97564-91-5
112514-54-2
196309-94-1
214899-21-5
265996-92-7
265996-93-8
173792-58-0
334974-07-1
HY/T0319—2021
附录B
(资料性）
特征离子质量色谱图
负离子和正离子模式下脂溶性海洋生物毒素特征离子色谱图如图B.1和图B.2所示。1. 4e5+
9 700
6 000-
2 000-
803.5>563.4
1141>1061
1. 0e4手
817.6>255.2
HomoYTX
1155.5>1075
负离子模式下脂溶性海洋生物毒素混合标准品溶液特征离子质量色谱图