【其他行业标准】 河豚毒素检测方法

ICS 07.060;13.020
中华人民共和国海洋行业标准
HY/T216—2017
河豚毒素检测方法
Determinationoftetrodotoxin
2017-02-21发布
国家海洋局
2017-06-01实施
规范性引用文件
术语和定义
仪器与设备
样品的制备和保存
样品测定
结果的表示与计算
精密度·
11实验注意事项·
附录A（资料性附录）
附录B（资料性附录）
附录C(资料性附录）
附录D(资料性附录)
河豚毒素标准样品及阳性样品的高效液相色谱图河豚毒素标准溶液的标准曲线图回收率数据
再现性数据
HY/T216—2017
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家海洋局第三海洋研究所提出。本标准由全国海洋标准化技术委员会（SAC/TC283)归口。本标准起草单位：国家海洋局第三海洋研究所、国家海洋局海洋标准计量中心。本标准主要起草人：陈伟珠、易瑞灶、袁玲玲、洪碧红、张怡评、洪专、晋文慧。HY/T216—2017
河豚毒素检测方法
HY/T216—2017
警告一一由于河豚毒素是剧毒的固体粉末，因此使用时应戴口罩和手套，注意避免吸入，配成溶液时避免与人体直接接触。若不慎接触到皮肤或眼部，应用大量水冲洗。严重时，立即送及医院。
1范围
本标准规定了贝类、鱼类中（不含其制品）河豚毒素的高效液相色谱荧光检测法。本标准适用于贝类、鱼类中(不含其制品)河豚毒素的测定。本标准对河豚毒素的检出限为0.1mg/kg，定量限为0.25mg/kg。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
河豚毒素
tetrodotoxin;TTX
某些科鱼类(如东方)体内所含的外源神经毒素，以血液和内脏器官的含量最多。小剂量有麻痹和镇痛作用，剂量稍大便可致死人命。结构式如下：o
4原理
6-CH2OH
利用河豚毒素溶于弱酸的性质进行提取，河豚毒素在强碱中可产生具有荧光性衍生物原理，采用柱后衍生-高效液相色谱荧光法进行检测，根据保留时间定性分析，峰面积定量分析。5试剂
除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和超纯水或相当纯度的水。1
HY/T216—2017
5.1辛烷磺酸钠(CH，NaO,S)，色谱纯。5.2二水合磷酸二氢钠（NaH,PO：·2H,O)。5.3十二水合磷酸氢二钠（NazHPO：·12HzO)。5.4氢氧化钠（NaOH)。
5.5乙酸（CH，COOH)，色谱纯。5.6辛烷磺酸钠的磷酸盐缓冲液：取辛烷磺酸钠（5.1)0.540g、二水合磷酸二氢钠（5.2)3.900g和十二水合磷酸氢二钠（5.3）8.954g，加水稀释定容至500mL，配置成辛烷磺酸钠浓度为1.080g/L，二水合磷酸二氢钠浓度为7.800g/L，十二水合磷酸氢二钠浓度为17.908g/L的混合溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤。
5.7氢氧化钠溶液：称取160g氢氧化钠（5.4)，以水溶解并稀释至1L，浓度为4mol/L，经0.45μm微孔滤膜过滤。
5.80.1%乙酸溶液：乙酸（5.5）十水（1+1000，体积比），用玻璃瓶贮存，室温保存。5.90.03%乙酸溶液：乙酸（5.5）十水（3+10000，体积比），用玻璃瓶贮存，现用现配。5.10.标准储备液：称取河豚毒素标准样品10mg（精确至0.01mg），置于100mL容量瓶中，加0.03%乙酸溶液（5.9）溶解并稀释至刻度，摇匀，作为储备液，其浓度为0.100mg/mL。标准储备液贮存于玻璃容器中，在4℃士2℃保存时，储备液可保存一个月。仪器与设备
6.1组织匀浆器。
6.2数显控温搅拌器。
6.3高速离心机，转速不小于12000r/min。6.4液相色谱仪配荧光检测器和柱后衍生装置。6.5微孔滤膜：0.45μm。
6.6分析天平，感量：0.01mg。
6.7分析天平，感量：0.001g。
6.8水浴锅。
样品的制备和保存
7.1样品的保存与预处理
新鲜贝类样品清洗沥干去壳，新鲜鱼类样品清洗后去皮取鱼肉。未能及时处理的样品应于一20℃保存，预处理前自然解冻。
7.2样品的提取
样品按以下步骤进行提取：
a）取预处理后的样品（7.1)，用组织匀浆器磨成糊状；b）称取5.0g（精确至0.001g）样品于烧杯中，加10mL0.1%乙酸溶液（5.8），在50℃水浴中搅拌加热10min，全部移至离心管中；再用5mL0.1%乙酸溶液（5.8）洗涤烧杯，并转移到离心管，以12000r/min转速离心20min)
后，取上清液转移到50mL容量瓶中；再分别用10mL0.1%乙酸溶液（5.8）洗涤沉淀3次，离心后转移至50mL容量瓶中，用0.03%d)
乙酸溶液(5.9)定容。
7.3样品提取液的保存
上述方法处理好的样品（7.2)未及时进样检测时，常温下可放置8h。8样品测定
8.1色谱条件
宜采用以下色谱条件：
色谱柱：分析柱ZORBAXSB-C8（4.6mmX250mm，5μm），或相当者；a）食
柱温：常温；
流动相：辛烷磺酸钠的磷酸盐缓冲液（5.6）；流速：0.3mL/min；
激发波长365nm，发射波长510nm；柱后衍生剂：氢氧化钠溶液（5.7)；衍生剂流速：0.3mL/min；
柱后衍生温度：110℃；bzxz.net
进样量：10μL。
2定性分析
HY/T216—2017
待测样品中目标化合物的色谱峰根据标准样品中目标化合物色谱峰的保留时间确认。3标准曲线的绘制
用0.03%乙酸溶液（5.9)逐级稀释标准储备液（5.10），配制标准工作液，标准工作液的浓度分别为0.1032μg/mL、0.4128μg/mL、1.032μg/mL、4.128μg/mL、10.32μg/mL、51.60μg/mL、103.2μg/mL。按8.1规定的色谱条件，按浓度从低到高依次测定上述标准工作液，以峰面积为纵坐标，以标准工作液浓度为横坐标，绘制标准曲线，标准曲线见附录B。8.4样品测定
取按上述制备样（7.2)适量，经0.45um微孔滤膜（6.5）过滤后，进行液相色谱测定。待测样中河豚毒素的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则稀释后再进样测定。8.5
空白试验
用水作为空白样品，按照7、8章的规定进行空白试验。9结果的表示与计算
按式(1)计算样品河豚毒素含量：A,Xc×V×1000
A.×m×1000
式中：
被测样品中的河豚毒素含量，单位为毫克每干克（mg/kg）：A，——被测样品中的河豚毒素峰面积；Cis
标准溶液中的河豚毒素浓度，单位为微克每毫升（μg/mL)；（1）
HY/T216—2017
A：—标准溶液中的河豚毒素峰面积；m—样品的质量，单位为克（g)；V—样品的定容体积，单位为毫升(mL)。计算结果保留三位有效数字。
精密度
在重复性条件下，对同一被测对象相互独立进行测试获得的两次独立测试结果绝对差值不大于这两个测定值的算术平均值的10%。在再现性条件下获得的实验室间的统计结果见附录D。11实验注意事项
在实验过程中应注意以下事项：高效液相色谱仪在使用结束后，应先将柱后衍生装置与色谱柱断开，色谱柱按常规洗柱方法进a)
行清洗，衍生泵用纯水低流速冲洗衍生泵2h以上；试验过程中，剩余的河豚毒素样品溶液不应随意丢弃，应加人碱溶液处理后再倒入废液中；b)）
试验过程中，相关的器血和器具应先采用碱溶液处理后再按常规清洗。c)
附录A
(资料性附录)
河豚毒素标准样品及阳性样品的高效液相色谱图HY/T216—2017
图A.1给出了河豚毒素标准样品的高效液相色谱图，图A.2给出了阳性河豚鱼肉样品的高效液相色谱图。
时间/min
河豚毒素标准样品(2.16μg/mL)的高效液相色谱图5.00
时间/min
阳性河豚鱼肉样品的高效液相色谱图30.00