【国家标准】 纳米技术 电子自旋共振（ESR）法检测金属氧化物纳米材料产生的活性氧（ROS）

ICS07.120
CCS C 04
中华人民共和国国家标准
GB/T41917—2022/IS0/TS18827：2017纳米技术
电子自旋共振（ESR）
法检测金属氧化物纳米材料
产生的活性氧（ROS）
Nanotechnologies-Electron spin resonance (ESR) as a method formeasuring reactive oxygen species (ROS) generated by metal oxide nanomaterials（IS0/TS18827:2017,IDT）
2022-10-12发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2023-05-01实施
规范性引用文件
术语、定义和缩略语
术语和定义
缩略语
4原理
自旋捕获方法
自由基阳性对照
芬顿反应[17]】
次黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶体系[18孟加拉红光敏作用[19,20]
样品制备
测试样品制备（金属氧化物纳米材料悬浮液）7.2产生羟基自由基的溶液制备
FeSO4溶液
H,O2溶液
7.3产生超氧阴离子的溶液制备
磷酸缓冲液
次黄嘌呤溶液
黄嘌呤氧化酶溶液
7.4产生单线态氧溶液的制备
自旋捕获剂的制备
DMPO储备液
GB/T41917—2022/ISO/TS18827:20175
GB/T41917—2022/ISO/TS18827:20177.5.3BMPO储备液
TPC储备液
7.6测试样品和自旋捕获剂之间的反应7.6.1
7.6.2DMPO的反应
BMPO的反应
TPC的反应
7.7阳性对照和自旋捕获剂的反应7.7.1DMPO自由基加合物的形成（DMPO/·OH）7.7.2BMPO自由基加合物的形成(BMPO/·OOH)7.7.3
TPC自由基加合物的形成（TPC/1O2）7.8用于自旋计算的标准物质的制备8影响因素
采样时间
操作步骤
样品注人
ESR测试
测试结果举例
DMPO/· OH
BMPO/·OOH
TPC/1O2
TEMPOL
参考文献
本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则起草。
GB/T41917—2022/IS0/TS18827:2017第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定电子自旋共振（ESR)法检测金属氧化物纳米材本文件等同采用ISO/TS18827：2017《纳米技术料产生的活性氧（ROS）》。文件类型由ISO的技术规范调整为我国的国家标准本文件做了下列最小限度的编辑性改动：参考文献重新排序
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中国科学院提出。
本文件由全国纳米技术标准化技术委员会（SAC/TC279)归口。本文件起草单位：国家纳米科学中心、许昌学院本文件主要起草人：吴晓春、纪英露、樊慧真、何伟伟Ⅲ
GB/T41917—2022/ISO/TS18827:2017引言
近年来，金属和金属氧化物纳米材料在生物医学和工业中的应用急剧增加。然而，大多数人造纳米材料的细胞毒性和遗传毒性的科学原理尚不完全清楚。活性氧（ROS)的产生是纳米毒性的一个重要机制。金属氧化物纳米材料的危害效应研究尚处于起步阶段。ROS的产生能力是金属氧化物纳米材料毒性的主要来源之一。过量的ROS可引起氧化应激，导致细胞不能维持正常的生理氧化还原调节功能，进而可能导致DNA损伤、细胞信号通路失调、细胞迁移变化、细胞毒性、细胞调亡和肿瘤的发生。ROS的产生取决于诸多关键因素，包括尺寸、形状、颗粒表面、表面正电荷、表面官能团、颗粒的溶解性、纳米金属和纳米金属氧化物释放的金属离子、紫外光激活、团聚、与细胞的作用方式、炎症以及介质的pHL4。因此，为了检测并定量金属氧化物纳米材料表面产生的ROS，本文件提出了电子自旋共振(ESR)法。
在ROS中，最具生物学相关性且被广泛研究的有羟基自由基（·OH）、超氧阴离子（O2）、单线态氧（\O2）和过氧化氢（H2O2）。然而，在室温下直接检测溶液中的某些自由基（如超氧阴离子和羟基自由基)是非常困难或不可能的[5]。ESR自旋捕获技术是研究瞬态自由基的一种非常有用的工具[6]。发展于20世纪60年代末的自旋捕获技术，是利用硝酮或硝基化合物（自旋捕获剂）与目标自由基反应，形成稳定的、可识别的自由基（自旋加合物），再使用ESR波谱仪检测的一种技术。自旋加合物可被ESR波谱仪直接检测。自旋加合物的ESR波谱具有特异性，可以提供ROS存在的指纹特征。
本文件规定了利用ESR检测金属氧化物纳米材料产生的5，5-二甲基-1-吡咯琳-N-氧化物（DMPO）和羟基自由基的加合物、5-叔丁氧羰基-5-甲基-1-吡咯-N-氧化物（BMPO)和超氧阴离子的加合物，以及2，2，5，5-四甲基-3-吡咯琳-3-氨甲酰胺（TPC)和单线态氧的加合物的方法。本文件提供了一种在非细胞环境下评估金属氧化物纳米材料产生ROS的方法。该方法可为处在理化性质评估阶段还未进行细胞毒性测试的纳米材料，提供有价值的ROS介导的细胞毒性预测信息。IV
1范围
GB/T41917—2022/IS0/TS18827:2017纳米技术电子自旋共振（ESR）
法检测金属氧化物纳米材料
产生的活性氧（ROS）
本文件描述了一种利用电子自旋共振（ESR)检测金属氧化物纳米材料在水溶液中产生的活性氧(ROS)（·OH、O2-和\O2）的方法。本文件不适用于未使用ROS特异性自旋捕获剂的ESR检测方法2规范性引用文件
本文件没有规范性引用文件。
3术语、定义和缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1.1
纳米材料
nanomaterial
任一外部维度、内部或表面结构处于纳米尺度的材料。注1：本通用术语包括纳米物体和纳米结构材料。注2：见ISO/TS80004-1：2015，2.8-2.10。［来源：ISO/TS80004-1:2015,2.4]3.1.2
试验样品
testsample
用于生物学试验、化学试验或评价的材料、器械、器械的一部分、组件、浸提液或其中一部分。［来源：GB/T16886.5—2017,3.53.1.3
零基线对照
zerobaselinecontrol
相当于未检测到自由基时的阳性对照注：例如，芬顿反应阳性对照的零基线对照为不含铁的H2O2和DMPO的混合溶液；次黄嘌岭-黄嘌呤氧化酶（HXXO)体系为不含HX-XO的次黄嘌呤和BMPO；孟加拉红光敏化体系为无光条件的孟加拉红和TPC3.1.4
阳性对照
positivecontrol
经充分表征的材料和/或物质。该材料和/或物质当用于某一规定试验方法评价时，证实该试验程序对于在试验系统中得出具有重复性的、适当阳性或反应性应答是适宜的。［来源：GB/T16886.12—2017,3.12］3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件。
GB/T41917-2022/ISO/TS18827：2017BMPO：5-叔丁氧羰基-5-甲基-1-吡咯啉-N-氧化物（5-tert-butoxycarbonyl-5-methyl-1-pyrroline-Noxide）
DMPO：5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物（5,5-dimethyl-1-pyrroline-N-oxide）DTPA：二亚乙基三胺五醋酸（diethylenetriaminepentaacetic acid）ESR：电子自旋共振（electronspinresonance）O-：超氧阴离子（superoxideanionradical）1O2：单线态氧（singletoxygen）OH-：氢氧根（hydroxideion）
·OH：羟基自由基（hydroxyl radical）ROS：活性氧（reactive oxygen species）TEMPOL：4-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基（4-hydroxyl-2,2，6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl)
TPC:2,2,5,5-四甲基-3-吡咯啉-3-氨甲酰胺（22,5,5-tetramethyl-3-pyrroline-3-carboxamide）4原理
4.1概述
大多数原子和分子中电子是配对的。配对电子不产生ESR信号，具有未成对电子的原子和分子才能产生ESR信号。当这些原子或分子处在磁场中时，未成对电子的自旋方向可以与磁场方向相同或相反，导致其具有不同的能量。因此外加磁场可解除未成对电子自旋态的简并。ESR波谱测量非简并自旋态间跃迁时微波辐射的吸收门。4.2自旋捕获方法
4.2.1概述
自旋捕获在ESR波谱法中用于检测和识别短寿命的自由基。理想情况下，自旋捕获剂和自由基形成的加合物对该自由基具有特异的ESR波谱特征。ESR波谱法采用自旋捕获剂可识别不同类型的ROS。
4.2.2DMPO
DMPO与其他硝酮类自旋捕获剂相比具有明显的优势，特别适用于识别以氧为中心的自由基，如超氧阴离子和羟基自由基。DMPO和羟基自由基的ESR信号由强度比为1：2：2：1的四重峰组成其超精细分裂常数αn=aH=1.49mT～1.5mT，与DMPO/·OH加合物一致[8。4.2.3BMPO
BMPO能形成ESR波谱可识别的加合物，适用于体内或体外短寿命超氧阴离子和羟基自由基的特异性检测[9]。其他硝酮类自旋捕获剂不易区分超氧自由基和羟基自由基，如DMPO-超氧加合物(t1/2=0.9min～1.3min）可自发衰变为DMPO-羟基加合物。而BMPO-超氧加合物不会衰变为羟基加合物且半衰期更长（t1/2=8.5min～15.7min）[1。BMPO-超氧加合物拟合得到超精细分裂常数a1.34mT和aH=1.18mT[11,12]。
对于单线态氧的检测，TPC具有适宜的灵敏度和动态范围[13]。TPC-单线态氧加合物ESR谱图显2
GB/T 41917—2022/ISO/TS18827:2017示出强度比为1：1：1的三重峰[14]，超精细分裂常数aα~=0.172mT[15]。注1：磁核的超精细分裂常数（a为谱线的超精细分裂，a：中的i为核的类型，例如iH、13C、14N)和ESR谱线的模式包含了这些自由基结构和几何结构的信息。注2：谱线宽度是共振频率-能量吸收状态的特征[16。4.3自由基阳性对照
芬顿反应、次黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶(HX-XO)体系和孟加拉红光敏剂体系能分别产生羟基自由基、超氧阴离子和单线态氧。这些体系证实了自旋捕获剂的适用性，自旋加合物可重复产生ESR信号特征，如强度比和超精细分裂。
4.3.1芬顿反应[17]
过渡金属离子可以激活H2O2，形成具有强氧化性的羟基自由基，称为“芬顿反应”。二价铁离子被双氧水氧化为三价铁离子，生成一个羟基自由基和一个氢氧根离子（反应1）。芬顿反应中产生的羟基自由基可以被DMPO捕获，形成自旋加合物DMPO/·OH（反应2）。Fe2++H2O2 →Fe3+ +. OH+OH
.OH+DMPO-→DMPO/.OH
4.3.2次黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶体系[18]···（反应1）
（反应2）
次黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶（HX-XO)体系能够产生超氧阴离子（反应3和反应4）。超氧阴离子可被BMPO捕获形成自旋加合物BMPO/·OOH（反应5）。黄嘌岭氧化酶、黄嘌呤+H202
次黄嘌呤+H20十02
（反应3）
黄嘌岭+H0+02
黄嘌呤氧化酶
尿酸+O2
O2-+BMPO→BMPO/.OOH
4.3.3孟加拉红光敏作用[19-20].（反应4）
··（反应5）
孟加拉红是单线态氧的光敏剂。当光激发时，孟加拉红将其激发态能量转移至氧分子产生单线态氧（反应6和反应7）。单线态氧可被TPC捕获形成加合物TPC/1O2（反应8）。光照(^mx约为550m）孟加拉红
孟加拉红
孟加拉红*+O2→孟加拉红+10
1 02+TPC→TPC/102
5试剂
使用分析纯试剂、去离子水或等同纯度的水。5.1自旋捕获剂，如DMPO、BMPO和TPC。·（反应6)
··.·（反应7)
·.·（反应8）
5.2阳性对照试剂，如FeSO4、H.O、磷酸缓冲液（pH7.4）、DTPA或螯合型离子交换树脂、次黄嘌呤黄嘌呤氧化酶、孟加拉红。
5.3去离子水（25°C时18.2MQ）。5.4自旋计算用标准物质，如TEMPOL。3
GB/T41917—2022/IS0/TS1882720176仪器
需要使用通用的实验仪器，特别是以下仪器：6.1实验室天平。
6.21.5mL离心管
6.310μL~1000μL移液器。
6.410μL～1000μL移液器枪头。6.5涡旋混合器。
6.6与1.5mL离心管配套的离心机，6.7
用于水溶液测量的石英（纯二氧化硅)样品池（平底样品池或细的毛细管样品池）。6.8光源（入max约550nm）。
ESR波谱仪。
7样品制备
测试样品制备（金属氧化物纳米材料悬浮液）用去离子水现配金属氧化物纳米材料分散溶液，并用移液器吹打或涡旋混合器迅速搅拌至均匀。每个样品大约需要500μL。因为超声处理可能产生自由基，所以不能超声[21]。按照8.1和OECD的相关文件[22]执行。
不同类型纳米材料产生的ROS种类和水平也不相同，需要通过实验确定纳米材料的浓度。根据ROS种类，在相同材料浓度下比较产生的ROS水平，按照9.3.9计算。7.2产生羟基自由基的溶液制备
7.2.1FeSO4溶液
将FeSO4溶解在去离子水中配成0.01mmol/L的溶液。每个样品准确取样50uL。应使用新配的FeSO.溶液进行实验。
7.2.2H202溶液
将HzO2用去离子水稀释为浓度为0.1mmol/L的溶液。每个样品准确取样50μL。应使用新配的H2O2溶液进行实验。
7.3产生超氧阴离子的溶液制备
7.3.1磷酸缓冲液
用去离子水配制磷酸缓冲液（100mmol/L，pH7.4）。每个样品准确取样70μL。注1：DTPA用于消除微量杂质金属离子可能造成的人为氧化[23]。注2：螯合型离子交换树脂是一种特殊的交换剂或整合剂，可用于制备磷酸盐缓冲液24.25]。7.3.2次黄嘌呤溶液
将次黄嘌呤溶解在100mmol/L磷酸缓冲液中制备成浓度为0.125μmol/L的溶液，每个样品准确取样100μL。
7.3.3黄嘌呤氧化酶溶液
GB/T41917—2022/ISO/TS18827:2017将黄嘌呤氧化酶溶解在100mmol/L磷酸缓冲液中制备成浓度为0.125U/mL的溶液，每个样品准确取样10μL。需要现配，在2℃～8℃储存。7.4产生单线态氧溶液的制备
将孟加拉红溶解在去离子水中配制成100umol/L的溶液，每个样品准确取样50μL。避光保存。7.5自旋捕获剂的制备
7.5.1概述下载标准就来标准下载网
含有任何顺磁杂质的自旋捕获剂，都会引起很大的背景和噪声信号，应使用高纯度的自旋捕获剂，若自旋捕获剂在不含纳米材料的情况下会产生ESR信号，应做对照实验。产生噪声的自旋捕获剂应使用活性炭等进行预纯化。
7.5.2DMPO储备液
使用的DMPO纯度应≥99%，在一20℃避光防潮储存。将DMPO溶解在去离子水中制成500mmol/L的溶液。测量时每个样品准确取样100μL。7.5.3BMPO储备液
使用的BMPO纯度应≥99%，在一20℃避光防潮储存。将BMPO溶解在去离子水中制成500mmol/L的溶液。测量时每个样品准确取样100μL。7.5.4TPC储备液
使用的TPC纯度应≥99%。将TPC溶解在去离子水中制成400mmol/L的溶液。测量时每个样品准确取样20μL。
7.6测试样品和自旋捕获剂之间的反应7.6.1概述
通过涡旋混合器或移液器混合均匀。不要使用超声处理，因为超声会产生自由基[21]，按照8.1执行。因为光照也会产生自由基[26]，所以制备过程中应避光。所有的自旋捕获剂都要进行基线校准。试剂的终浓度见表1。
表1捕获剂的终浓度
捕获剂名称
次黄嘌岭
终浓度
50.0mmol/L
1.0μmol/L
10.0 μmol/L
50.0mmol/L
62.5μmol/L
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