【国家标准】 食品安全国家标准 食品微生物学检验 唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（椰毒假单胞菌酵米面亚种）检验

中华人民共和国国家标准
GB4789.29—2020
食品安全国家标准
食品微生物学检验
唐蒲佰克霍尔德氏菌
（椰毒假单胞菌酵米面亚种）检验2020-09-11发布
中华人民共和国国家卫生健康委员会国家市场监督管理总局
2021-03-11实施
本标准代替GB/T4789.29—2003《食品卫生微生物学检验本标准与GB/T4789.29—2003相比，主要变化如下：标准名称修改为“食品安全国家标准胞菌酵米面亚种)检验”；
修改了范围；
修改了设备和材料；
修改了培养基和试剂；
修改了检验程序；
增加了结果报告；
增加了附录A。
GB4789.29—2020
椰毒假单胞菌酵米面亚种检验》。食品微生物学检验
唐喜蒲伯克霍尔德氏菌（毒假单1范围
食品安全国家标准
食品微生物学检验
唐首蒲伯克霍尔德氏菌
（椰毒假单胞菌酵米面亚种）检验GB4789.29—2020
本标准规定了食品中唐营蒲伯克霍尔德氏菌（椰毒假单胞菌酵米面亚种）［Burkholderiagladioli（Pseudomonascocovenenanssubsp.farinofermentans）的检验方法。本标准适用于食品中唐喜蒲伯克霍尔德氏菌（椰毒假单胞菌酵米面亚种）的检验设备和材料
实验室常规灭菌设备
冰箱：2℃~8℃、-20℃~-30℃。2.2
恒温培养箱：26℃士1℃、36℃士1℃。恒温水浴锅：46℃土1℃。
显微镜：10倍100倍。
均质器。
离心机：3000r/min。
电子天平：感量0.1g。
比浊计。
锥形瓶：容量100mL、500mL。
无菌培养Ⅲ：直径90mm、直径150mm无菌透明玻璃纸、滤纸，
无菌灌胃器：1mL。
微生物生化鉴定系统。
小鼠：18g～20g，每一批次试验应使用同一品系的KM或ICR小鼠。培养基和试剂
GVC增菌液：见A.1。
改良马铃薯葡萄糖琼脂（mPDA)：见A.2。马铃薯葡萄糖琼脂（PDA)：见A.2.1。PCFA培养基：见A.3。
马铃薯葡萄糖半固体琼脂：见A4。卵黄琼脂：见A.5。
革兰氏染色液：见A.6。
氧化酶试剂：见A.7。
Hugh-Leifson培养基（O/F试验用）见A.8蛋白陈水（靛基质试验用）：见A.9。缓冲葡萄糖蛋白陈水（MR和V-P试验用）：见A.10西蒙氏柠檬酸盐培养基，见A,13。苯丙氨酸培养基：见A.14。
糖发酵醇管：见A.15
半固体琼脂：见A.16。
抗O多价血清、型特异性因子血清（O-用、O-N、O-V、O-M.O-M、0-量)。生化鉴定试剂盒。
检验程序
唐营蒲伯克霍尔德氏菌（律毒假单胞菌酵来面亚种）检验程序见图1，检样
1.鲜银耳1g+20mLGVC增菌液
2.其他食品25g（mL）+225mLGVC增菌液36℃±1℃20h~24h
mPDA和PCFA
36℃±1℃
卵黄琼脂平板
36℃±1℃48h±2h
生化试验
24h~48h
革兰氏染色
PDA平板
36℃±1℃24h±2h
血清学分型（可选择项）
结果报告
GB4789.29—2020免费标准下载网bzxz
氧化酶试验
毒性试验
26℃±1℃
米醇菌酸测定
唐高蒲伯克霍尔德氏苗（椰毒假单胞菌酵米面亚种）检验程序图1
操作步骤
样品处理
GB4789.29—2020
无菌操作称取25g（mL）样品，置入盛有225mLGVC增菌液的无菌均质袋中（鲜银耳样品取1g，用剪刀剪碎，加入盛有20mLGVC增菌液的无菌均质袋中），用拍击式均质器拍打1min～2min；或置人盛有225mLGVC增菌液的无菌均质杯中，以8000r/min~10000r/min均质1min~2min；若样品为液态，振荡混匀。
将上述样品增菌液置36℃土1℃培养20h~24h。分离
用直径3mm的接种环取增菌液一环，分别划线接种于mPDA平板和PCFA平板，36℃士1℃培养24h～48h。观察各个平板上生长的菌落，各个平板上菌落特征见表1。表1
唐蒲伯克霍尔德氏菌（椰毒假单胞菌酵米面亚种）在不同分离平板上的菌落特征培养基
mPDA平板
PCFA平板
卵黄琼脂平板
初筛试验
菌落特征
培养24h后，菌落1mm~2mm，紫色，光滑、显润、边缘整齐：培养48h后，部分菌落中心可有呈草帽状凸起
培养24h后，菌落0.5mm~1mm，灰白色，光滑、湿润、边缘整齐培养24h后，菌落2mm~3mm，表面光滑、湿润：培养48h后，菌落周围形成乳白色混浊环，斜射光下可见菌落及周围培养基表面呈虹彩现象自选择性琼脂平板上分别挑取5个以上典型或可疑菌落（低于5个全选），分区划线接种于卵黄琼脂平板，36℃士1℃培养。挑取培养18h24h的菌落进行革兰氏染色及氧化酶试验。对于革兰氏染色阴性、氧化酶试验阴性的菌继续培养至48h士2h，对于卵磷脂酶阳性，带有虹彩环的单个菌落，接种PDA平板，36℃±1℃培养24h2h。5.5
生化试验
从纯培养的PDA平板上挑取菌苔进行生化鉴定。唐营蒲伯克霍尔德氏菌（椰毒假单胞菌醇酵米面亚种)生化特征见表2。可选择生化鉴定试剂盒或微生物生化鉴定系统表2唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（椰毒假单胞菌酵米面亚种）生化特征生化试验
O/F试验（氧化型）
葡萄糖
半乳糖
阿拉伯糖
甘露醇
侧金盏花醇
卫茅醇
卵磷脂酶
氧化酶
明胶液化
硝酸盐还原
柠橡酸盐利用
精氨酸
石蕊牛乳
靛基质
苯丙氨酸脱氨酶
H.S产生
生化试验
注：+表示阳性：一表示阴性。
血清学分型（可选择项）
菌体抗原的制备
表2（续）
GB4789.29—2020
将PDA平板36℃士1℃培养24h士2h的培养物用无菌生理盐水洗下，沸水浴（100℃）2h，10min离心弃上清液，再用无菌生理盐水稀释至5×10°CFU/mL~1×10°CFU/mL3000r/min
菌悬液，作为凝集试验用抗原。5.6.2
菌体抗原的鉴定
用多价血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。与多价血清凝集者，依次用O-Ⅲ、O-IV、OV、O-V、O-MI、O-训因子血清做试管凝集试验。根据试验结果，判定菌体抗原型。在生理盐水中自凝者不能分型。生化特征符合，但不能与以上血清凝集者，需保留菌株做进一步鉴定。4
5.7毒性试验
5.7.1产毒培养
GB4789.29—2020
将初步鉴定为唐营蒲伯克霍尔德氏菌（椰毒假单胞菌酵米面亚种）的菌株接种PDA平板，36C土1℃，培养24h士2h，用灭菌接种环刮取适量菌苔，加到3mL无菌生理盐水的试管中，配成1麦氏浓度（McFarland，MCF）的菌悬液（约为10CFU/mL），用无菌吸管吸取0.5mL，滴在铺好无菌玻璃纸的直径150mm马铃薯葡萄糖半固体平板上，用无菌L棒涂布均匀，26℃土1℃培养5d。取下带菌的玻璃纸，将半固体平板置于100℃流动蒸汽灭菌30min。室温冷却后，置一20℃～一30℃冰箱过夜。将冰冻好的半固体平板置室温融化，用无菌吸管吸出冻融液，经滤纸过滤至无菌试管或锥形瓶中（此为毒素粗提液），4℃避光保存。
同时，将未接种菌苔、铺好无菌玻璃纸的直径150mm马铃薯葡萄糖半固体平板作为阴性对照，按照同样的试验方法制备阴性对照粗提液，4℃避光保存。5.7.2毒力测定
取毒素粗提液或经100℃水浴蒸发后的5倍10倍浓缩液，灌胃小鼠3只，每只0.5mL，观察至7d。若菌株产生米酵菌酸，小鼠在灌胃后20min~24h内发病。主要症状为竖毛、萎糜不振、躁动，继而行步蹦珊、肢体麻痹、瘫软、抽搐，呈角弓反张状，呼吸急促、死亡。取阴性对照粗提液或经100℃水浴蒸发后的5倍～10倍浓缩液，灌胃小鼠3只，每只0.5mL，观察至7d。小鼠应健康存活。
5.7.3米酵菌酸测定
毒力测定实验阳性时，分别取毒素粗提液，阴性对照粗提液，按照GB5009.189执行。结果报告
生化试验符合且毒性试验阳性，报告检出唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（椰毒假单胞菌酵米面亚种）：生化试验和毒性试验有一项不符合，报告未检出唐营蒲伯克霍尔德氏菌（椰毒假单胞菌酵米面亚种）。5
GVC增菌液
马铃薯葡萄糖水（PD水）
A.1.1.1成分
马铃薯（去皮）
葡萄糖
蒸馏水
A.1.1.2制法
附录A
培养基和试剂
1000mL
GB4789.29—2020
称取300g去皮马铃薯，切碎块，加1000mL蒸馏水，煮沸10min～20min。用纱布过滤，补加蒸馏水至1000mL。加人葡萄糖，加热溶化，分装，121℃高压20min。A.1.2
龙胆紫水溶液
龙胆紫
蒸馏水
取0.1g龙胆紫，用少量蒸馏水溶解后，加蒸馏水，稀释到100mL，保存在棕色瓶内。使用前过滤除菌。
氯霉素溶液
A.1.3.1成分
氯霉素
蒸馏水
20.0mg氟霉素溶解于10.0mL蒸馏水，过滤除菌A.1.4
GVC增菌液
每100mLPD水中加人龙胆紫水溶液1.0mL、氯霉素溶液1.0mL，混匀，分装后置于4℃备用混合液中龙胆紫和氯霉素的终浓度分别为10μg/mL和20μg/mL6
改良马铃薯葡萄糖琼脂（ModifiedPotatoDextroseAgar，mPDA）A.2.1
马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）
马铃薯（去皮）
葡萄糖
蒸馏水
1000ml
GB4789.29—2020
称取300g去皮马铃薯，切碎块，加1000mL蒸馏水，煮沸10min~20min。用纱布过滤，补加蒸馏水至1000mL。加人葡萄糖和琼脂，加热溶化，分装，121℃高压灭菌20min。A.2.2
龙胆紫水溶液
A.2.2.1成分
龙胆紫
蒸馏水
A.2.2.2制法
取0.1g龙胆紫，用少量蒸馏水溶解后，加蒸馏水，稀释到100mL，保存在棕色瓶内。使用前过滤除菌。
氯霉素溶液
A.2.3.1成分
氯霉素
蒸馏水
A.2.3.2制法
20.0mg氯霉素溶解于10.0mL蒸馏水，过滤除菌。A.2.4
改良马铃薯葡萄糖琼脂（mPDA）临用时加热溶解PDA琼脂，冷却至50℃，每100mLPDA中加入龙胆紫水溶液1.0mL、氟霉素溶液1.0mL，混匀后倾注平板。龙胆紫和氯霉素的终浓度分别为10ug/mL和20μg/mL。A.3
PCFA培养基
NazHPO
MgSO,7H,0
FeSO..7H,0
胱氨酸
葡萄糖
卫茅醇
琼脂粉
蒸馏水
PCFA基础培养基制法
1000ml
将上述成分加热溶解后，调节pH，115℃高压灭菌15min，备用。A.3.3
选择性添加剂
硫酸多黏菌素B：50000U
林肯霉素：30000U
GB4789.29—2020
将PCFA基础培养基加热融化冷却至50℃后，加人选择性添加剂，混勾后倾注无菌平Ⅲ中，备用。马铃薯葡萄糖半固体琼脂
A.4.1成分
马铃薯（去皮）
葡萄糖
蒸馏水
A.4.2制法
1000ml
称取300g去皮马铃薯，切碎块，加1000mL蒸馏水，煮沸10min～20min。用纱布过滤，补加蒸馏水至1000mL。加入葡萄糖和琼脂，加热溶化，分装，121℃高压20min。A.5
卵黄琼脂
基础培养基成分
肉浸液
蛋白陈
氯化钠
1000ml
25g~30g
50%卵黄盐水悬液
卵黄琼脂的制备
GB4789.29—2020
制备基础培养基，分装每瓶100mL。121℃高压灭菌15min。临用时加热溶化琼脂，冷至50℃，每瓶内加入50%葡萄糖水溶液2mL和50%卵黄盐水悬液10mL~15mL，摇匀，倾注平板A.6
革兰氏染色液
结晶紫染色液
A.6.1.1成分
结晶紫
95%乙醇
1%草酸铵水溶液
将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。A.6.2
革兰氏碘液
A.6.2.1成分
碘化钾
蒸馏水
A.6.2.2制法
将碘与碘化钾先进行混合，加人蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。A.6.3
沙黄复染液
A.6.3.1成分
95%乙醇
蒸馏水
A.6.3.2制法
将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。A.6.4
染色法
将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。滴加95%乙醇脱色，约15s~30s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗，滴加复染液，复染1min，水洗、待干、镜检。9
氧化酶试剂
N,N.N',N'-四甲基对苯二胺盐酸盐蒸馏水
少量新鲜配制，于冰箱内避光保存，在7d之内使用。A.7.3
试验方法
GB4789.29—2020
取单个特征性菌落，涂布在氧化酶试剂湿润的滤纸上。如果滤纸在10s之内未变为紫红色、紫色或深蓝色，则为氧化酶试验阴性，否则即为氧化酶实验阳性。注：实验中切勿使用镍/铬材料。A.8
Hugh-Leifson培养基（O/F试验用）A.8.1
蛋白陈
氯化钠
磷酸氢二钾
葡萄糖
0.2%溴糜香草酚蓝溶液
蒸馏水
1000mL
将蛋白陈和盐类加水溶解后，校正pH至7.2士0.2。加人葡萄糖、琼脂煮沸，溶化琼脂，然后加入指示剂。混勾后，分装试管，121℃高压15min，直立凝固备用A.8.3
试验方法
从斜面上挑取小量培养物作穿刺接种，同时接种两管培养基，其中一管于接种后滴加溶化的1%液体石蜡于表面（高度约1cm），36℃士1℃培养结果
见表A.1。
反应类型
发醇型(F)
O/F试验结果
封口的培养基
开口的培养基
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