【国家标准】 食品安全国家标准 食品中维生素B6的测定

中华人民共和国国家标准
GB5009.154—2023
食品安全国家标准
食品中维生素B6的测定
2023-09-06发布
中华人民共和国国家卫生健康委员会国家市场监督管理总局
2024-03-06实施
GB5009.154—2023
食品中维生素B的测定》
本标准代替GB5009.154—2016《食品安全国家标准本标准与GB5009.154—2016相比，主要变化如下：卡液相色谱-串联质谱法、第二法增加了第一法
液相色谱-质谱法；
修改了第三法
微生物法。
高效液相色谱-荧光检测法、第四法1范围
食品安全国家标准
食品中维生素B的测定
本标准规定了食品中维生素B的测定方法。第一法液相色谱-串联质谱法适用于食品中维生素B的测定。GB5009.154—2023
第二法液相色谱-质谱法适用于添加维生素B（吡哆胺、吡哆醛和吡哆醇）作为营养强化剂的调制乳粉、特殊膳食用食品、即食谷物、焙烤食品和饮料中的维生素B（吡哆胺、吡哆醛和吡哆醇）的测定第三法高效液相色谱-荧光检测法适用于添加维生素B（吡哆胺、吡哆醛和吡哆醇）作为营养强化剂的调制乳粉、特殊膳食用食品（特殊医学用途食品除外）、即食谷物、焙烤食品和饮料中的维生素B（吡哆胺、吡哆醛和吡哆醇）的测定。第四法微生物法适用于食品中维生素B的测定。第一法液相色谱-串联质谱法
2原理
食品中的维生素B（吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺），先经酸水解处理，再经酶解为吡哆胺、吡哆醛和吡哆醇，稀释、过滤后，反相液相色谱分离，串联质谱检测，同位素内标法定量，以吡哆醇计的方式计算维生素B总含量。
试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。3.1试剂
甲醇（CHOH）：色谱纯。
甲酸（HCOOH）：色谱纯。
甲酸铵（HCOONH）：色谱纯。
氢氧化钠（NaOH）。
盐酸（HCD
α-淀粉酶：酶活力≥50U/mg。
酸性磷酸酶：酶活力≥0.5U/mg。木瓜蛋白酶：酶活力≥800U/mg。试剂配制
盐酸溶液（0.1mol/L）：准确吸取9mL盐酸，用水稀释至1000mL。氢氧化钠溶液（0.1mol/L）：准确称取0.4g氢氧化钠，加50mL水溶解，冷却后，用水稀释至1
GB5009.154—2023
3.2.3流动相A（10mmol/L甲酸铵的2%甲酸水溶液）：称取0.63g甲酸铵，先后加人约950mL水溶解，加入甲酸20mL，用水稀释至1.000mL后混匀，超声脱气备用。3.2.4流动相B(0.1%甲酸-甲醇溶液）：吸取1mL甲酸，用甲醇稀释至1000mL，超声混匀。3.3标准品
3.3.1盐酸吡哆醇（CHCINO，CAS号：58-56-0）：纯度≥98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.3.2盐酸吡哆醛（CgHlCINO，CAS号：65-22-5）：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.3.3双盐酸吡哆够胺（CHC1.N.O2，CAS号：524-36-7）：纯度99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.3.413C,-盐酸吡哆醇（13C,C,H2CINO）：纯度≥98%。3.3.5D,-吡哆醛（CD,H.NO.CAS号：1173023-49-8)：纯度≥98%。3.3.6D-双盐酸吡哆胺（C.DHnCl,NzOg，CAS号：1173023-45-4)：纯度≥98%。3.4标准溶液配制
3.4.1吡哆醇标准储备液（1.00mg/mL）：准确称取60.8mg盐酸吡哆醇标准品，用0.1mol/L盐酸溶液溶解并稀释至50mL棕色容量瓶中，再转移至棕色玻璃试剂瓶中，于一20℃下避光贮存，有效期3个月。
3.4.2吡哆醛标准储备液（1.00mg/mL）：准确称取60.9mg盐酸吡哆醛标准品，用0.1mol/L盐酸溶液溶解并稀释至50mL棕色容量瓶中，再转移至棕色玻璃试剂瓶中，于一20℃下避光烂存，有效期3个月。
3.4.3吡哆胺标准储备液（1.00mg/mL）：准确称取71.7mg双盐酸吡哆胺标准品，用0.1mol/L盐酸溶液溶解并稀释至50mL棕色容量瓶中，再转移至棕色玻璃试剂瓶中，于一20℃下避光贮存，有效期3个月。
3.4.4维生素B标准混合储备液（50.0μg/mL）：分别准确吸取吡哆胺、吡哆醛、吡哆醇标准储备液（(1.00mg/mL）各5.00mL.用0.1mol/L盐酸溶液稀释至100mL棕色容量瓶中，再转移至棕色玻璃试剂瓶中，于一20℃下避光存，有效期3个月3.4.5维生素B标准混合工作液（5.00μg/mL）：准确吸取1.00mL维生素B标准混合储备液（50.0μg/mL），用流动相A稀释至10mL棕色容量瓶中。临用现配。3.4.6维生素B标准混合工作液（500ng/mL）：准确吸取1.00mL维生素B,标准混合储备液（5.00μg/mL），用流动相A稀释至10mL棕色容量瓶中。临用现配。3.4.7维生素B标准混合工作液（500ng/mL）：准确吸取1.00mL维生素B标准混合储备液（500ng/mL）.用流动相A稀释至10mL棕色容量瓶中。临用现配。注：冷冻状态的储备液使用前应在室温条件下解冻，混勾。3.5同位素内标溶液配制
3.5.113C-吡哆醇同位素内标储备液（100ug/mL）：准确称取12.1mg（精确至0.1mg）13C,-盐酸吡哆醇，用0.1mol/L盐酸溶液溶解并稀释至100mL棕色容量瓶中，再转移至棕色玻璃试剂瓶中，于一20℃下避光贮存，有效期3个月。3.5.2D-吡哆醛同位素内标储备液（100μg/mL）：准确称取10.0mg（精确至0.1mg）D-盐酸吡哆醛，用0.1mol/L盐酸溶液溶解并稀释至100mL棕色容量瓶中，再转移至棕色玻璃试剂瓶中，于一20℃下2
避光贮存，有效期3个月
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3.5.3D-吡哆胺同位素内标储备液（100μg/mL）：准确称取14.3mg（精确至0.1mg）Ds-双盐酸吡哆胺，用0.1mol/L盐酸溶液溶解并稀释至100mL棕色容量瓶中，再转移至棕色玻璃试剂瓶中，于20℃下避光贮存，有效期3个月。3.5.4维生素B同位素内标混合工作液（10.0μg/mL）：分别准确吸取D,-吡哆胺、D-吡哆醛和C-吡哆醇同位素内标储备液（100μg/mL）各10mL，转移至100mL棕色容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀，再转移至棕色玻璃试剂瓶中，于一20℃下避光贮存，有效期1个月。注：冷冻状态的储备液使用前应在室温条件下解冻、摇匀。3.6标准系列工作液配制bzxZ.net
分别准确吸取适量维生素B标准混合工作液至100mL棕色容量瓶中，各准确加人50L维生素B同位素混合内标工作液（10.0ug/mL）用流动相A稀释至刻度，该维生素B（吡哆胺、吡哆醛和吡哆醇）标准系列工作液的质量浓度分别为0.100ng/mL、0.500ng/ml、1.00ng/mL、2.00ng/mL、5.00ng/ml，10.0ng/mL和20.0ng/mL，它们对应的同位素内标浓度都为5.00ng/mL。临用现配注：标准储备液浓度校正方法参照附录A仪器和设备
4.1液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源。4.2天平：感量分别为0.01g和0.1mg。4.3
恒温培养箱，或性能相当者。
4.4pH计：精度0.01。
涡旋混合器。
分光光度计。
高速粉碎机。
勾浆机。
恒温水浴锅或高压灭菌锅。
分析步骤
试样制备
肉类、蔬菜、水果等取可食部分，水洗干净，用干纱布擦去表面水分，经匀浆机匀浆，储存于样品瓶中备用：粉状样品（奶粉、米粉等）经混匀后，直接取样：液体样品摇匀后备用；有颗粒液体样品，如大颗粒酸奶等经匀浆机匀浆后备用：片状、颗粒状样品，经高速粉碎机磨成粉状，封存备用。所制试样应避光冷藏，尽快测定。
5.2试样处理
5.2.1含淀粉的试样
固体试样：准确称取混合均匀的固体试样1g~5g（精确至0.01g）于150mL具塞锥形瓶中5.2.1.1
（带有软质塞子），加500μL维生素B，同位素内标混合工作液（10.0μg/mL），加人50ml0.1mol/LHCI溶液，使得样品分散开，塞上软质塞子，置于100℃水浴或121℃灭菌锅中水解30min，冷却至室3
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温，取出。用氢氧化钠溶液（0.1mol/L）调pH至4.2~4.8后，准确加人20mg酸性磷酸酶、100mg木瓜蛋白酶、10mgα-淀粉酶，向锥形瓶中充氮，盖上瓶塞充分混匀，于37℃恒温箱中酶解18h以上，待溶液冷却至室温后，转移至100mL棕色容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。5.2.1.2液体试样：准确称取混合均匀的液体试样5g～20g（精确至0.01g）于150mL具塞锥形瓶中（带有软质塞子），加人500μL维生素B,同位素内标混合工作液（10.0μg/mL），加入50mL0.1mol/LHCI溶液，使得样品分散开，塞上软质塞子，置于100℃水浴或121℃灭菌锅中水解30min，冷却至室温，取出。用氢氧化钠溶液（0.1mol/L）调pH至4.2~4.8后，准确加人20mg酸性磷酸酶、100mg木瓜蛋白酶、10mgα-淀粉酶，向锥形瓶中充氮，盖上瓶塞充分混匀，于37℃恒温箱中酶解18h以上，待溶液冷却至室温后，转移至100mL棕色容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。5.2.2不含淀粉试样
5.2.2.1固体试样：称取混合均匀的固体试样1g～5g（精确至0.01g）于150mL具塞锥形瓶中（带有软质塞子），加入500μL维生素B同位素内标混合工作液（10.0μg/mL），加入50mL0.1mol/LHCl溶液，使得样品分散开，塞上软质塞子，置于100℃水浴或121℃灭菌锅中水解30min，冷却至室温取出。用氢氧化钠溶液（0.1mol/L）调pH至4.2~4.8后，准确加人20mg酸性磷酸酶、100mg木瓜蛋白酶，向锥形瓶中充氮，盖上瓶塞充分混匀，于37℃恒温箱中酶解18h以上，待溶液冷却至室温后，转移至100mL棕色容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀5.2.2.2液体试样：称取混合均匀的液体试样5g～20g（精确至0.01g）于150mL具塞锥形瓶中（带有软质塞子），加入500μL维生素B同位素内标混合工作液（10.0μg/mL），加人50mL0.1mol/LHCl溶液，使得样品分散开，塞上软质塞子，置于100℃水浴或121℃灭菌锅中水解30min，冷却至室温取出。用氢氧化钠溶液（0.1mol/L）调pH至4.2~4.8后，准确加人20mg酸性磷酸酶、100mg木瓜蛋白酶，向锥形瓶中充氮，盖上瓶塞充分混匀，于37℃恒温箱中酶解18h以上·得溶液冷却至室温后，转移至100mL棕色容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀注1：操作者可根据试样的维生素B的含量，以及本实验室质谱仪的灵敏度，在不低于标准曲线测定范围要求的条件下，调整称样量和同位素内标的加入量。注2：测定添加维生素B（吡哆胺、吡哆醛和吡哆醇）作为营养强化剂的产品，前处理方法可参考12.25.2.3待测液的制备
另取50mL锥形瓶，放人漏斗和滤纸，把稀释样液混匀后倒入其中，自然过滤，得过滤液20mL以上。准确吸取1.00mL过滤液于10mL棕色容量瓶中，用流动相A稀释至刻度，涡旋混勾后用0.22um微孔滤膜过滤，转移至棕色进样瓶中待测5.3仪器测定条件
5.3.1色谱参考条件
色谱参考条件如下：
色谱柱：硅胶基质五氟苯基柱（粒径1.8μm，3.0mmX150mm），或相当者；a）
流动相A10mmol/L甲酸铵2%甲酸的水溶液；流动相B：0.1%甲酸-甲醇溶液；c）
流速：0.4mL/min；
柱温：30℃；
进样体积：10μL
流动相洗脱梯度见表1。
质谱参考条件
质谱参考条件如下：
电离方式：ESI+；
流动相及梯度洗脱条件
流动相A
监测方式：多反应监测（MRM)；毛细管电压：3.10kV；
锥孔电压：30V；
离子源温度：150℃；
锥孔反吹气流量：150L/h；
脱溶剂气温度：350℃；
脱溶剂气流量：600L/h；
流动相B
锥孔电压和碰撞能量见表2，定量离子质谱图参见附录B。表2
化合物名称
吡哆醇
1C-吡够醇
吡哆醛
D-吡哆醛
吡哆胺
D-吡够胺
定量离子。
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mL/min
维生素B各组分和它们各自对应的同位素内标的MRM质谱参数母离子
锥孔电压
子离子
碰撞能量
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5.4标准曲线的制作
将维生素B混合标准系列工作液浓度由低到高分别注入液相色谱-质谱仪中，以吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺的工作液浓度为横坐标，以吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺与它们各自对应的同位素内标的峰面积比值为纵坐标，分别绘制吡哆胺、吡哆醛、吡够醇的标准曲线。5.5试样溶液的测定
将待测溶液进样，根据上述绘制的3条标准曲线，内标法计算待测试样溶液中吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺的浓度。
6定性测定
试样中目标化合物色谱峰的保留时间与相应标准色谱峰的保留时间相比较，变化范围应在士2.5%之内：每种化合物的质谱定性离子必须出现，至少应包括一个母离子和两个子离子，而且同一检测批次对同一化合物试样溶液中的离子相对丰度与标准溶液的离子相对丰度比符合表3的要求。表3试样溶液中离子相对丰度的允许偏差范围相对离子丰度
允许相对偏差
6分析结果的表述
>20%~50%
试样中维生素B各组分的含量按式(1)计算e,xVixV
mXV.X1000
式中：
>10%~20%
试样中吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺的各自含量，单位为毫克每千克（mg/kg）：≤10%
试样溶液中吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺的质量浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；试样提取液的最终稀释体积，单位为毫升（mL）：过滤溶液的定容体积，单位为毫升（mL）；试样质量，单位为克（g）；
准确吸取过滤溶液的体积，单位为毫升（mL）；单位换算系数。
6.2维生素B（以吡哆醇计）总含量试样中维生素B总含量按式（2)计算。X=X十XX1.012十X#X1.006
式中：
试样中维生素B。（以吡哆醇计）总含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；试样中吡哆醇的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；试样中吡哆醛的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）：吡哆醛换算成吡哆醇的转换系数；试样中吡哆胺的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）：吡哆胺换算成吡哆醇的转换系数。·（2)
结果保留3位有效数字。
7精密度
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在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。8其他
8.1固体试样：当称样量为1.00g时，方法的检出限为：吡哆醇0.03mg/kg，吡哆醛0.03mg/kg，吡哆胺0.03mg/kg；定量限为：吡哆醇0.10mg/kg，吡哆醛0.10mg/kg，吡哆胺0.10mg/kg。8.2液体试样：当称样量为5.00g时，方法的检出限：吡哆醇0.01mg/kg，吡哆醛0.01mg/kg，吡哆胺0.01mg/kg：定量限为：吡哆醇0.02mg/kg，吡哆醛0.02mg/kg，吡哆胺0.02mg/kg。液相色谱-质谱法
第二法
9原理
食品中添加的维生素B（吡哆醇、吡够醛、吡哆胺），经提取、稀释、过滤，反相液相色谱柱分离，氮素、单四极杆质谱检测，同位素稀释内标法对吡哆胺、吡哆醛和吡哆醇分别定量，以吡够醇计的方式计算维生素B总含量。
10试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。10.1试剂
甲醇（CHOH）：色谱纯
甲酸（HCOOH）：色谱纯。
甲酸铵（HCOONH）：色谱纯。
盐酸（HCI)。
氢氧化钠(NaOH)。
α-淀粉酶：酶活力≥50U/mg。
试剂配制
盐酸溶液（0.1mol/L）：准确吸取9mL盐酸，用水稀释至1000mL。氢氧化钠溶液（0.1mol/L）：准确称取0.4g氢氧化钠，加50mL水溶解，冷却后，用水稀释至100mL。
10.2.3流动相A（10mmol/L甲酸铵的2%甲酸水溶液）：准确称取0.63g甲酸铵，先后加人约950mL水溶解，准确加入甲酸20ml，用水稀释至1000mL，混匀，超声脱气备用。10.2.4流动相B（0.1%甲酸-甲醇溶液）：吸取1mL甲酸，用甲醇稀释至1000mL，超声混匀。10.3标准品
盐酸吡哆醇（C.HCINO，CAS号：58-56-0）：纯度98%，或经国家认证并授予标准物质证书10.3.1
的标准品。
GB5009.154—2023
10.3.2盐酸吡哆醛（C.HCINO，CAS号：65-22-5）：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。
10.3.3双盐酸吡哆胺（CH1tCl,N.Oz，CAS号：524-36-7)：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。
10.3.43C-盐酸吡哆醇（13C,C,HzCINO，）：纯度≥98%。10.3.5D-吡哆醛（C.DH.NO.CAS号：1173023-49-8）：纯度≥98%。10.3.6D.-双盐酸吡哆胺（C.D,HnClN.OzCAS号：1173023-45-4)：纯度≥98%。10.4标准溶液配制
吡哆醇标准储备液（1.00mg/mL）：准确称取60.8mg盐酸吡哆醇标准品，用0.1mol/L盐酸溶10.4.1
液溶解并转移至50mL棕色容量瓶中，稀释至刻度，再转移至棕色玻璃试剂瓶中，于一20℃下避光赔存，有效期3个月。
10.4.2吡够醛标准储备液（1.00mg/mL）：准确称取60.9mg盐酸吡哆醛标准品，用0.1mol/L盐酸溶液溶解并转移至50mL棕色容量瓶中，稀释至刻度，再转移至棕色玻璃试剂瓶中，于一20℃下避光贮存，有效期3个月。
10.4.3吡哆胺标准储备液（1.00mg/mL）：准确称取71.7mg双盐酸吡哆胺标准品，用0.1mol/L盐酸溶液溶解并转移至50mL棕色容量瓶中，稀释至刻度，再转移至棕色玻璃试剂瓶中，于一20℃下避光贴存，有效期3个月。
10.4.4维生素B，标准混合储备液（50.0μg/mL）：分别准确吸取吡哆胺、吡哆醛、吡哆醇标准储备液（1.00mg/mL）各5.00mL于100mL棕色容量瓶中，用0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，再转移至棕色玻璃试剂瓶中，于一20℃下避光购存，有效期3个月。10.4.5维生素B标准混合工作液（5.00ug/mL）：准确吸取1.00mL维生素B，标准混合储备液（50.0μg/mL）于10mL棕色容量瓶中，用流动相A稀释至刻度。临用现配。10.4.6维生素B标准混合工作液（500ng/mL）：准确吸取1.00mL维生素B标准混合工作液（5.00μg/mL）于10mL棕色容量瓶中，用流动相A稀释至刻度。临用现配。10.4.7维生素B标准混合工作液（50.0ng/mL）：准确吸取1.00mL维生素B标准混合工作液（500ng/mL）于10mL棕色容量瓶中，用流动相A稀释至刻度。临用现配注：冷冻状态的储备液使用前应在室温条件下解冻，播勾、10.5同位素内标溶液配制
10.5.113C4-吡哆醇同位素内标储备液（1.00mg/mL）：称取12.1mg（精确至0.1mg）C4-盐酸吡哆醇，用0.1mol/L盐酸溶液溶解并转移至10mL棕色容量瓶中，稀释至刻度，再转移至棕色玻璃试剂瓶中，于一20℃下避光贮存，有效期3个月。10.5.2D-吡哆醛同位素内标储备液（1.00mg/mL）：称取10.0mg（精确至0.1mg）D-盐酸吡哆醛，用0.1mol/L盐酸溶液溶解并转移至10mL棕色容量瓶中，稀释至刻度，再转移至棕色玻璃试剂瓶中，于一20℃下避光贮存，有效期3个月。10.5.3D-吡哆胺同位素内标储备液（1.00mg/mL）：称取14.3mg（精确至0.1mg）D-双盐酸吡哆胺，用0.1mol/L盐酸溶液溶解并转移至10mL棕色容量瓶中，稀释至刻度，再转移至棕色玻璃试剂瓶中，于一20℃下避光贮存，有效期3个月。10.5.4维生素B同位素内标混合工作液（50.0μg/mL）：分别准确吸取5mLD，-吡哆胺同位素内标储备液（1.00mg/mL）、D-吡哆醛同位素内标储备液（1.00mg/mL）、13C,-吡哆醇同位素内标储备液（1.00mg/mL）于100mL棕色容量瓶中，用水稀释至刻度，再转移至棕色玻璃试剂瓶中，于一20℃下避光贮存，使用期为1个月。
注：冷冻状态的储备液使用前应在室温条件下解冻，摇勾8
10.6标准系列工作液配制
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分别准确吸取适量维生素B标准混合工作液至50ml棕色容量瓶中，准确加人100μL维生素B同位素内标混合工作液（50.0ug/mL）.用流动相A稀释至刻度，该维生素B（吡哆胺、吡哆醛和吡哆醇）标准系列作液的质量浓度分别为10.0ng/mL、20.0ng/mL、40.0ng/mL100ng/mL、200ng/ml和250ng/mL，它们对应的同位素内标浓度均为100ng/ml。临用现配。注：标准储备液校正方法参照附录A。11
仪器和设备
液相色谱-质谱仪：配电喷雾离子源。天平：感量分别为0.01g和0.1mg。11.2
恒温培养箱，或性能相当者。
pH计：精度0.01。
涡旋混合器。
分光光度计。
高速粉碎机。
匀浆机。
恒温水浴锅。
分析步骤
试样制备
粉状样品（奶粉、米粉等）经混匀后，直接取样；液体样品摇匀后备用；片状、颗粒状样品，经高速粉碎机磨成粉状或均质机均质，封存备用。所制试样应避光冷藏，尽快测定。12.2试样处理
12.2.1含淀粉试样
12.2.1.1固体试样：称取混合均匀的固体试样1g~5g（精确至0.01g）.加人0.4mL的维生素B同位素混合内标工作液，再加人约25mL温水（45℃～50℃）溶解.用盐酸溶液或氢氧化钠溶液调pH为6.0～6.5，加入0.1gα淀粉酶于150mL具塞锥形瓶中，振荡混匀后向锥形瓶中充氮，盖上瓶塞，置于50℃～60℃培养箱内约30min。取出冷却至室温。12.2.1.2液体试样：称取混合均匀的液体试样5g~20g（精确至0.01g）.加人0.4ml.的维生素B同位素混合内标工作液，再加入20mL水，用盐酸溶液或氢氧化钠溶液调pH为6.0～6.5.加人0.1gα-淀粉酶于150mL具塞锥形瓶中，振荡混匀后向锥形瓶中充氮，盖上瓶塞，置于50℃～60℃培养箱内约30min。取出冷却至室温。
12.2.2不含淀粉试样
12.2.2.1固体试样：称取混合均匀的固体试样1g～5g（精确至0.01g），于150mL具塞锥形瓶中，准确加入0.4mL的维生素B同位素混合内标工作液.再加入约25mL水溶解并振荡混匀。12.2.2.2液体试样：称取混合均匀的液体试样5g～20g（精确至0.01g），于150mL具塞锥形瓶中，准9
GB5009.154—2023
确加入0.4mL的维生素B.同位素混合内标工作液，再加人20mL水，涡旋混勾。12.2.3
待测液的制备
用盐酸溶液调节上述试样溶液的pH至1.7土0.1,放置约1min。再用氢氧化钠溶液（0.1mol/L）调节试样溶液的pH至4.5士0.1。把上述具塞锥形瓶放人超声波振荡器中，超声振荡10min后，将试样溶液震荡并转移至100mL棕色容量瓶中。用水反复洗涤具塞锥形瓶2次～3次，全部洗涤液转移至100mL棕色容量瓶中，并用水稀释至刻度。另取50mL锥形瓶，放人漏斗和滤纸，把稀释后的试样溶液倒人其中，自然过滤。准确吸取5mL过滤液于10mL棕色容量瓶中，用流动相A稀释至刻度，混匀后用0.22μm微孔滤膜过滤，转移至棕色进样瓶中待测。注：对添加形式为5-磷酸吡哆醛的试样，则需经过酸水解与酸性磷酸酶处理，具体参考5.2.2执行12.3
仪器测定条件
色谱参考条件
色谱参考条件如下：
色谱柱：硅胶基质五氟苯基反相液相色谱柱（粒径1.8um，3.0mmX150mm），或相当者；流动相A：10mmol/L甲酸铵2%甲酸的水溶液；流动相B：0.1%甲酸-甲醇溶液；流速：0.4mL/min；
柱温：30℃；
进样体积：20L；
流动相洗脱梯度见表4。
质谱参考条件
质谱参考条件如下：
电离模式：ESI+；
流动相及梯度洗脱条件
流动相A
监测方式：选择离子反应监测(SIR)；探头温度：600℃；
毛细管电压：0.80kV；
流动相B
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